Optogenetica, studio evoluzione e applicazioni
Accensioni e spegnimenti
A livello di base, il sistema nervoso può essere pensato come un circuito elettrico altamente complesso. Ogni neurone contiene una varietà di proteine di pompa e canale che controllano il flusso di ioni attraverso la sua membrana, mantenendo una potenziale membrana negativa nel neurone a riposo. Segnali di attivazione, ad esempio da neurotrasmettitori, fanno sì che gli ioni caricati positivamente fluiscano nella cellula dall'ambiente esterno attraverso queste proteine del canale, causando la depolarizzazione della membrana. A una certa soglia, questo innesca un potenziale d'azione - un rapido afflusso di ioni di sodio che inverte efficacemente la tensione all'interno della cellula, dando inizio a una reazione a catena di afflusso di ioni sodio che si propaga lungo la lunghezza dell'assone, causando infine il rilascio di neurotrasmettitori che stimolano o inibiscono la produzione di impulsi elettrici nei neuroni vicini.
I microelettrodi si sono storicamente dimostrati utili per la stimolazione diretta (meno per l'inibizione) dei neuroni negli studi neurofisiologici, sebbene il basso limite di risoluzione imposto da questo regime sperimentale abbia lasciato i neuroscienziati affamati di alternative. Lo sviluppo di neurotrasmettitori "in gabbia" - modificati chimicamente per rimanere inattivi a meno che non siano attivati dall'illuminazione laser - e canali ionici foto-commutabili modificati chimicamente hanno permesso notevoli miglioramenti nella precisione per studi funzionali, sebbene con possibilità limitate di applicazione.
Tuttavia, la vera rivoluzione è arrivata con la scoperta della channelrhodopsina delle proteine alghe, che consente l'afflusso di ioni positivi in risposta all'illuminazione con luce blu per agire come un interruttore "acceso" 1 ( Fig. 1 ). Pochi anni dopo, gli scienziati hanno riconosciuto il potenziale della halo-rodopsina della proteina arcaica, che innesca l'influsso di ioni cloro caricati negativamente in risposta alla luce gialla e quindi iperpolarizza la cellula, per agire come un interruttore "spento" 2 . Entrambe queste proteine possono essere facilmente introdotte nelle cellule bersaglio mediante varie tecniche, consentendo agli scienziati di attivare e disattivare in modo rapido e preciso i singoli neuroni senza la necessità di ulteriori farmaci o sostanze chimiche.
Controllo dei circuiti neurali con la luce
Sebbene questo campo dell'optogenetica sia relativamente nuovo, gli scienziati hanno già fatto notevoli progressi nella mappatura dei circuiti cerebrali funzionali su lunghe distanze - ad esempio, mappando i processi neuronali che collegano i due emisferi della corteccia cerebrale nei topi. Altri studi preliminari hanno applicato questo approccio allo studio dei disturbi del cervello, utilizzando halorhodopsina e channelrhodopsina per caratterizzare i circuiti neurali presi di mira dalla stimolazione cerebrale profonda, che è una strategia terapeutica efficace ma poco conosciuta per la malattia di Parkinson in stadio avanzato.
Attualmente sono in corso molti sforzi per perfezionare le tecniche optogenetiche. Sebbene i virus offrano un mezzo efficace e clinicamente applicabile per la consegna dei geni che codificano queste rodopsine, è ancora un processo laborioso sviluppare costrutti che massimizzino l'efficienza della consegna e dell'espressione genica. Inoltre, sebbene la rodopsina e l'halorodopsina del canale naturalmente funzionino bene, vi è un suggerimento che le versioni modificate di queste proteine potrebbero offrire una migliore sensibilità alla luce e quindi una commutazione più rapida. Saranno necessarie migliori modalità di erogazione della luce per migliorare l'accuratezza e l'efficienza delle strategie optogenetiche 3; Le alternative oggetto dell'inchiesta comprendono serie di diodi emettitori di luce (LED) indirizzabili separatamente che coprono efficacemente più settori cerebrali di interesse e sistemi di illuminazione a infrarossi che possono penetrare in profondità all'interno dei tessuti densi del cervello.
Neuroscienza guidata da laser
Le metodologie optogenetiche fondamentali sono ben consolidate; avendo dimostrato che queste rodopsine attivate dalla luce sono tollerate e funzionali nel cervello dei mammiferi, gli scienziati sono ora concentrati sull'uso di questi strumenti per la ricerca di base e clinica.
Le scoperte nella scienza dei materiali ora consentono la coltivazione di neuroni in modelli predeterminati complessi. La capacità di stimolare o silenziare le singole cellule in modo selettivo all'interno di queste culture ingegnerizzate, in combinazione con reagenti che consentono la visualizzazione diretta dell'attività neuronale, promette di fornire intuizioni che potrebbero informare la progettazione di reti neurali artificiali basate sui principi naturali alla base della struttura e della funzione cerebrale .
Fig. 2: mappatura automatizzata basata sulla luce della corteccia motoria del topo. Una configurazione sperimentale. Topi transgenici anestetizzati sono stimolati dal raggio laser. La risposta del motore viene rilevata dagli elettrodi elettromiografici (EMG). b fetta di tessuto cerebrale incorporato in agarosio mirata da un laser di stimolazione. c Profondità di intensità dell'area illuminata mentre il raggio passa attraverso l'agarosio e attraverso la superficie corticale.
Anche l'ambiente complesso del cervello vivente è alla portata di queste tecniche 4 . Ad esempio, è ora possibile utilizzare i "tubi luminosi" per fornire illuminazione a determinate aree del cervello del mouse, attivare circuiti olfattivi, indurre il movimento dei baffi o attivare i centri motori per attivare l'attività fisica ( Fig. 2 ) 5 , 6 . Questi successi nei modelli animali sono solo un preludio a un obiettivo a più lungo termine: la terapia genica optogenetica negli esseri umani. Gli studi hanno già dimostrato che la sensibilità alla luce può essere ripristinata sui topi con deficit di fotorecettore, fornendo il gene channelrhodopsina nelle cellule della retina 7 , 8. Alla fine, i sistemi di somministrazione virale potrebbero consentire strategie terapeutiche simili negli esseri umani per curare la cecità derivante dalla degenerazione maculare e da altri disturbi - un'alternativa promettente agli approcci terapeutici basati su impianti più invasivi.
È in corso anche il lavoro precoce usando optogenetica per migliorare il trattamento del morbo di Parkinson 9. La stimolazione cerebrale profonda utilizza elettrodi piccoli per l'eccitazione mirata di determinati settori cerebrali, ma soffre di una mancanza di risoluzione spaziale e di una tendenza a causare l'inattivazione involontaria dei neuroni non bersaglio. Pertanto, l'uso di fattori optogenetici potrebbe fornire un miglioramento della precisione molto necessario, con una risoluzione su scala micrometrica anziché su scala millimetrica. In linea di principio, un approccio simile potrebbe essere applicato per trattare l'epilessia, utilizzando halorhodopsina per consentire l'inibizione selettiva delle regioni cerebrali coinvolte nell'insorgenza delle crisi. Il trattamento di questi e di altri disordini neurologici potrebbe, ad esempio, teoricamente comportare l'associazione di una strategia di terapia genica attentamente predisposta e un dispositivo impiantabile per la stimolazione optogenetica.
L'optogenetica offre già grandi opportunità per la ricerca di base delle neuroscienze, come è già stato dimostrato da molti laboratori in tutto il mondo; anche se le applicazioni biomediche devono ancora affrontare sfide e rischi imprevedibili, queste aree di ricerca offrono grandi promesse per la ridefinizione delle strategie terapeutiche neurologiche in futuro.
Nagel, G. et al.
Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 13940–13945 (2003).
Source
Zhang, F. et al.
Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.
Nature 446, 633–639 (2007).
Source
Rickgauer, J. P. & Tank, D. W.
Twophoton excitation of channelrhodopsin-2 at saturation.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 15025–15030 (2009).
Source
Han, X. et al.
Millisecond-timescale optical control of neural dynamics in the nonhuman primate brain.
Neuron 62, 191–198 (2009).
Source
Petreanu, L. et al.
Channelrhodopsin-2- assisted circuit mapping of long-range callosal projections.
Nature Neurosci. 10, 663–668 (2007).
Source
Ayling, O. G. et al.
Automated light-based mapping of motor cortex by photoactivation of channelrhodopsin-2 transgenic mice.
Nature Methods 6, 219–224 (2009).
Source
Bi, A. et al.
Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration.
Neuron 50, 23–33 (2006).
Source
Lagali, P. S. et al.
Light-activated channels targeted to ON bipolar cells restore visual function in retinal degeneration.
Nature Neurosci. 11, 667–675 (2008).
Source
Gradinaru, V. et al.
Optical deconstruction of Parkinsonian neural circuitry.
Science 324, 354–359 (2009).
Source
Sa Defenza
"L’optogenetica è un tecnica molto recente che permette di studiare il cervello di mammiferi ed altri animali, la nascita risale alla metà degli anni 2000 e si basa su ricerche fatte negli anni ’70 su come certe proteine conosciute come rodopsine funzionino come pompe di ioni attivate dalla luce, la parte proteica che effettivamente reagisce allo stimolo si chiama opsina da qui il nome optogenetica." ultimavoce/optogenetica-cura-malattie-cervello/
Le proteine sensibili alla luce consentono agli scienziati di attivare o disattivare i neuroni in modo selettivo con una precisione senza precedenti. L'introduzione di queste proteine in cellule coltivate o nel cervello di animali vivi consente di studiare la struttura e la funzione delle reti neurali. Questi strumenti "optogenetici" mantengono anche la promessa clinica, con la possibilità di modulare l'attività dei circuiti cerebrali coinvolti in disturbi neurologici o di ripristinare la perdita della vista.
I metodi tradizionali per l'analisi funzionale dei neuroni si sono basati sulla stimolazione diretta da piccoli elettrodi, sebbene l'efficacia sia indebolita dalla limitata precisione spaziale e temporale con cui le singole cellule possono essere mirate selettivamente. Come tale, la recente comparsa di strumenti optogenetici - interruttori geneticamente codificati che consentono ai neuroni di essere accesi o spenti con lampi di luce - promette di rivoluzionare lo studio di come i neuroni operano singolarmente e come membri di reti più grandi, e potrebbe infine offrire nuove speranze per i pazienti che soffrono di disturbi visivi o di disturbi neurologici come l'epilessia o il morbo di Parkinson.
I metodi tradizionali per l'analisi funzionale dei neuroni si sono basati sulla stimolazione diretta da piccoli elettrodi, sebbene l'efficacia sia indebolita dalla limitata precisione spaziale e temporale con cui le singole cellule possono essere mirate selettivamente. Come tale, la recente comparsa di strumenti optogenetici - interruttori geneticamente codificati che consentono ai neuroni di essere accesi o spenti con lampi di luce - promette di rivoluzionare lo studio di come i neuroni operano singolarmente e come membri di reti più grandi, e potrebbe infine offrire nuove speranze per i pazienti che soffrono di disturbi visivi o di disturbi neurologici come l'epilessia o il morbo di Parkinson.
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Fig. 1: Rappresentazione schematica dell'azione di channelrhodopsina e halorhodopsina su cellule neurali. L'attivazione con luce blu apre il canale (channelrhodopsina), permettendo agli ioni di sodio di attivare il neurone 'on'; la luce gialla (su halorhodopsina) introduce ioni di cloruro, disattivano il neurone.
© Per gentile concessione di Gary Carlson / Science Photo Library
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Accensioni e spegnimenti
A livello di base, il sistema nervoso può essere pensato come un circuito elettrico altamente complesso. Ogni neurone contiene una varietà di proteine di pompa e canale che controllano il flusso di ioni attraverso la sua membrana, mantenendo una potenziale membrana negativa nel neurone a riposo. Segnali di attivazione, ad esempio da neurotrasmettitori, fanno sì che gli ioni caricati positivamente fluiscano nella cellula dall'ambiente esterno attraverso queste proteine del canale, causando la depolarizzazione della membrana. A una certa soglia, questo innesca un potenziale d'azione - un rapido afflusso di ioni di sodio che inverte efficacemente la tensione all'interno della cellula, dando inizio a una reazione a catena di afflusso di ioni sodio che si propaga lungo la lunghezza dell'assone, causando infine il rilascio di neurotrasmettitori che stimolano o inibiscono la produzione di impulsi elettrici nei neuroni vicini.
I microelettrodi si sono storicamente dimostrati utili per la stimolazione diretta (meno per l'inibizione) dei neuroni negli studi neurofisiologici, sebbene il basso limite di risoluzione imposto da questo regime sperimentale abbia lasciato i neuroscienziati affamati di alternative. Lo sviluppo di neurotrasmettitori "in gabbia" - modificati chimicamente per rimanere inattivi a meno che non siano attivati dall'illuminazione laser - e canali ionici foto-commutabili modificati chimicamente hanno permesso notevoli miglioramenti nella precisione per studi funzionali, sebbene con possibilità limitate di applicazione.
Tuttavia, la vera rivoluzione è arrivata con la scoperta della channelrhodopsina delle proteine alghe, che consente l'afflusso di ioni positivi in risposta all'illuminazione con luce blu per agire come un interruttore "acceso" 1 ( Fig. 1 ). Pochi anni dopo, gli scienziati hanno riconosciuto il potenziale della halo-rodopsina della proteina arcaica, che innesca l'influsso di ioni cloro caricati negativamente in risposta alla luce gialla e quindi iperpolarizza la cellula, per agire come un interruttore "spento" 2 . Entrambe queste proteine possono essere facilmente introdotte nelle cellule bersaglio mediante varie tecniche, consentendo agli scienziati di attivare e disattivare in modo rapido e preciso i singoli neuroni senza la necessità di ulteriori farmaci o sostanze chimiche.
Controllo dei circuiti neurali con la luce
Sebbene questo campo dell'optogenetica sia relativamente nuovo, gli scienziati hanno già fatto notevoli progressi nella mappatura dei circuiti cerebrali funzionali su lunghe distanze - ad esempio, mappando i processi neuronali che collegano i due emisferi della corteccia cerebrale nei topi. Altri studi preliminari hanno applicato questo approccio allo studio dei disturbi del cervello, utilizzando halorhodopsina e channelrhodopsina per caratterizzare i circuiti neurali presi di mira dalla stimolazione cerebrale profonda, che è una strategia terapeutica efficace ma poco conosciuta per la malattia di Parkinson in stadio avanzato.
Attualmente sono in corso molti sforzi per perfezionare le tecniche optogenetiche. Sebbene i virus offrano un mezzo efficace e clinicamente applicabile per la consegna dei geni che codificano queste rodopsine, è ancora un processo laborioso sviluppare costrutti che massimizzino l'efficienza della consegna e dell'espressione genica. Inoltre, sebbene la rodopsina e l'halorodopsina del canale naturalmente funzionino bene, vi è un suggerimento che le versioni modificate di queste proteine potrebbero offrire una migliore sensibilità alla luce e quindi una commutazione più rapida. Saranno necessarie migliori modalità di erogazione della luce per migliorare l'accuratezza e l'efficienza delle strategie optogenetiche 3; Le alternative oggetto dell'inchiesta comprendono serie di diodi emettitori di luce (LED) indirizzabili separatamente che coprono efficacemente più settori cerebrali di interesse e sistemi di illuminazione a infrarossi che possono penetrare in profondità all'interno dei tessuti densi del cervello.
Neuroscienza guidata da laser
Le metodologie optogenetiche fondamentali sono ben consolidate; avendo dimostrato che queste rodopsine attivate dalla luce sono tollerate e funzionali nel cervello dei mammiferi, gli scienziati sono ora concentrati sull'uso di questi strumenti per la ricerca di base e clinica.
Le scoperte nella scienza dei materiali ora consentono la coltivazione di neuroni in modelli predeterminati complessi. La capacità di stimolare o silenziare le singole cellule in modo selettivo all'interno di queste culture ingegnerizzate, in combinazione con reagenti che consentono la visualizzazione diretta dell'attività neuronale, promette di fornire intuizioni che potrebbero informare la progettazione di reti neurali artificiali basate sui principi naturali alla base della struttura e della funzione cerebrale .
Fig. 2: mappatura automatizzata basata sulla luce della corteccia motoria del topo. Una configurazione sperimentale. Topi transgenici anestetizzati sono stimolati dal raggio laser. La risposta del motore viene rilevata dagli elettrodi elettromiografici (EMG). b fetta di tessuto cerebrale incorporato in agarosio mirata da un laser di stimolazione. c Profondità di intensità dell'area illuminata mentre il raggio passa attraverso l'agarosio e attraverso la superficie corticale.
Anche l'ambiente complesso del cervello vivente è alla portata di queste tecniche 4 . Ad esempio, è ora possibile utilizzare i "tubi luminosi" per fornire illuminazione a determinate aree del cervello del mouse, attivare circuiti olfattivi, indurre il movimento dei baffi o attivare i centri motori per attivare l'attività fisica ( Fig. 2 ) 5 , 6 . Questi successi nei modelli animali sono solo un preludio a un obiettivo a più lungo termine: la terapia genica optogenetica negli esseri umani. Gli studi hanno già dimostrato che la sensibilità alla luce può essere ripristinata sui topi con deficit di fotorecettore, fornendo il gene channelrhodopsina nelle cellule della retina 7 , 8. Alla fine, i sistemi di somministrazione virale potrebbero consentire strategie terapeutiche simili negli esseri umani per curare la cecità derivante dalla degenerazione maculare e da altri disturbi - un'alternativa promettente agli approcci terapeutici basati su impianti più invasivi.
È in corso anche il lavoro precoce usando optogenetica per migliorare il trattamento del morbo di Parkinson 9. La stimolazione cerebrale profonda utilizza elettrodi piccoli per l'eccitazione mirata di determinati settori cerebrali, ma soffre di una mancanza di risoluzione spaziale e di una tendenza a causare l'inattivazione involontaria dei neuroni non bersaglio. Pertanto, l'uso di fattori optogenetici potrebbe fornire un miglioramento della precisione molto necessario, con una risoluzione su scala micrometrica anziché su scala millimetrica. In linea di principio, un approccio simile potrebbe essere applicato per trattare l'epilessia, utilizzando halorhodopsina per consentire l'inibizione selettiva delle regioni cerebrali coinvolte nell'insorgenza delle crisi. Il trattamento di questi e di altri disordini neurologici potrebbe, ad esempio, teoricamente comportare l'associazione di una strategia di terapia genica attentamente predisposta e un dispositivo impiantabile per la stimolazione optogenetica.
L'optogenetica offre già grandi opportunità per la ricerca di base delle neuroscienze, come è già stato dimostrato da molti laboratori in tutto il mondo; anche se le applicazioni biomediche devono ancora affrontare sfide e rischi imprevedibili, queste aree di ricerca offrono grandi promesse per la ridefinizione delle strategie terapeutiche neurologiche in futuro.
Anche se il canale cationico ridotto alla luce channelrhodopsina2 (ChR2) è usato come il principale strumento optogenetico in centinaia di laboratori neurobiologicamente orientati in tutto il mondo, poco si sa del meccanismo molecolare di base. Gli scienziati del Max Planck Institute of Biophysics di Francoforte hanno recentemente dimostrato che ChR2 è una pompa protonica con perdita di luce, per cui la perdita rappresenta le proprietà del canale ( Feldbauer, K. et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 106 , 12317 -12322, 2009 ) .
RIFERIMENTI
Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 13940–13945 (2003).
Source
Zhang, F. et al.
Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.
Nature 446, 633–639 (2007).
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Rickgauer, J. P. & Tank, D. W.
Twophoton excitation of channelrhodopsin-2 at saturation.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 15025–15030 (2009).
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Millisecond-timescale optical control of neural dynamics in the nonhuman primate brain.
Neuron 62, 191–198 (2009).
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Channelrhodopsin-2- assisted circuit mapping of long-range callosal projections.
Nature Neurosci. 10, 663–668 (2007).
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Ayling, O. G. et al.
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Bi, A. et al.
Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration.
Neuron 50, 23–33 (2006).
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Lagali, P. S. et al.
Light-activated channels targeted to ON bipolar cells restore visual function in retinal degeneration.
Nature Neurosci. 11, 667–675 (2008).
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Gradinaru, V. et al.
Optical deconstruction of Parkinsonian neural circuitry.
Science 324, 354–359 (2009).
Source
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