Nanoparticelle lipidiche biodegradabili per la modifica del genoma nel cervello tramite somministrazione intratecale

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/42388231/
Songtao Dong a 1,Lauren Healy b 1,Fanglin Gong c,Yue Xu a,Yunshu Cai a b,Nicholas C. Solek c,Jingan Chen c,Muye Zhou a,Tyler Thomson c,Margarita Savguira c,Sijin Luozhong a,Yanchao Zhang a,Tingzhen He c,Gen Li c,Bowen Li a b cUNLeslie Dan, Facoltà di Farmacia, Università di Toronto, Toronto, Ontario M5S 3M2, CanadaBDipartimento di Chimica, Università di Toronto, Toronto, Ontario M5G 1L7, CanadaCIstituto di Ingegneria Biomedica, Università di Toronto, Toronto, Ontario M5S 3G9, CanadaRicevuto il 31 agosto 2025, revisionato il 18 novembre 2025, accettato il 26 novembre 2025, disponibile online il 29 novembre 2025, versione definitiva il 23 gennaio 2026 .

Astratto
La somministrazione non virale di editori genici basata sull'RNA messaggero (mRNA) offre un potenziale rivoluzionario per l'editing genomico terapeutico nelle malattie neurologiche, ma una somministrazione efficiente e sicura al cervello rimane una sfida formidabile a causa della barriera emato-encefalica. 

La somministrazione intratecale fornisce una via clinicamente validata per aggirare questa barriera, tuttavia i principi di progettazione per nanoparticelle lipidiche biodegradabili (LNP) ottimizzate per la somministrazione al sistema nervoso centrale (SNC) rimangono poco definiti. In questo studio, abbiamo sintetizzato una libreria combinatoriale di 200 membri di lipidi ionizzabili biodegradabili strutturalmente diversi utilizzando la reazione a tre componenti di Passerini. 

Lo screening in vivo ad alto rendimento ha identificato P3B, un lipide capostipite che incorpora legami degradabili e gruppi di testa ionizzabili ottimizzati, che consente una somministrazione intratecale di mRNA potente e ben tollerata. 

Nei topi reporter Ai9, le nanoparticelle lipidiche P3B-LNP contenenti mRNA/sgRNA di Cas9 hanno indotto un'espressione robusta e diffusa di tdTomato nei neuroni e negli astrociti in diverse regioni cerebrali, raggiungendo un'efficienza di editing sostanzialmente superiore rispetto al benchmark clinico DLin-MC3-DMA (MC3). 

Nei topi reporter LumA, le nanoparticelle lipidiche P3B-LNP hanno mediato un efficiente editing delle basi di adenina, ripristinando l'espressione della luciferasi in tutto il cervello con una correzione on-target del 14,8% e un'attività off-target minima. 

Rispetto a MC3, le nanoparticelle lipidiche P3B-LNP hanno mostrato una migliore tollerabilità, con risposte infiammatorie attenuate e un profilo di sicurezza che supporta somministrazioni ripetute. 

Questi risultati stabiliscono le nanoparticelle lipidiche P3B-LNP come una piattaforma potente, sicura e biodegradabile per l'editing genomico nel cervello e sottolineano il potenziale della chimica lipidica combinatoria e dello screening in vivo ad alto rendimento per accelerare lo sviluppo di nanoparticelle lipidiche di nuova generazione per terapie a base di mRNA mirate al sistema nervoso centrale.

Abstract grafico

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Introduzione
La somministrazione di editor genici basata sull'RNA messaggero (mRNA) è emersa come un approccio trasformativo per la modifica precisa del genoma, consentendo l'espressione transitoria di nucleasi programmabili come Cas9 e editor di basi di adenina o citosina [ 1 , 2 ]. Questa strategia si basa sul successo clinico dei vaccini COVID-19 di Pfizer-BioNTech e Moderna, che hanno dimostrato la sicurezza, la scalabilità e la versatilità della somministrazione di mRNA mediata da LNP [ 3 ]. 

Da allora, le strategie basate sull'mRNA si sono rapidamente espanse a diverse applicazioni, tra cui l'immunoterapia del cancro [ [4] , [5] , [6] ], la sostituzione proteica [ [7] , [8] , [9] ] e la modifica del genoma [ 10 , 11 ]. Tra queste, la modifica genetica nel cervello rappresenta una frontiera particolarmente promettente ma impegnativa. Molte malattie neurologiche, tra cui disturbi neurodegenerativi, sindromi dello sviluppo e tumori cerebrali, sono causate da mutazioni genetiche ben caratterizzate e potrebbero essere potenzialmente curate mediante correzione o modulazione genica mirata [ 12 , 13 ]. Tuttavia, le grandi dimensioni e la complessità strutturale degli editor genici rappresentano ostacoli sostanziali per la somministrazione: l'mRNA di Cas9 supera i 4,5 kb e gli editor di basi possono raggiungere i 5,5 kb, rendendoli significativamente più grandi e più difficili da incapsulare e somministrare rispetto ai tradizionali mRNA terapeutici. 

Questi limiti dimensionali, combinati con la barriera emato-encefalica restrittiva, limitano gravemente l'efficienza e la distribuzione degli editor genici nel sistema nervoso centrale. Collettivamente, molti disturbi neurologici contribuiscono in modo sostanziale alla morbilità e alla mortalità globali e rimangono incurabili nonostante i significativi progressi nel trattamento sintomatico [ 14 ]. Questo potenziale terapeutico ha alimentato i crescenti sforzi per lo sviluppo di piattaforme di somministrazione in grado di indirizzare in modo sicuro ed efficiente gli editor genici al cervello [ 15 ]. Ad oggi, tuttavia, non è stato ancora possibile ottenere un'efficace somministrazione non virale di grandi editor genici basati su mRNA, in particolare editor di basi, al cervello adulto, il che rappresenta un importante collo di bottiglia nell'editing genomico del sistema nervoso centrale.

Le nanoparticelle lipidiche (LNP) sono emerse come i vettori non virali clinicamente più avanzati per la somministrazione di editor genici basati su mRNA, offrendo un profilo di sicurezza ben consolidato, scalabilità e comprovata utilità clinica [ 16 ]. Il loro design modulare consente la messa a punto della formulazione per diversi bersagli tissutali, esemplificato dal successo clinico epocale della terapia CRISPR basata su LNP di Intellia per la modifica del genoma diretta al fegato [ 10 , 17 , 18 ]. Le LNP sono state anche ingegnerizzate per consentire la modifica del genoma nella milza e nei polmoni [ [19] , [20] , [21] ]. Nonostante questi progressi, rimane un'esigenza critica insoddisfatta di sistemi di somministrazione in grado di ottenere una somministrazione potente, sicura e diffusa di editor genici basati su mRNA al cervello.

Il cervello è protetto dalla barriera emato-encefalica (BEE), un'interfaccia endoteliale altamente selettiva che regola rigorosamente il passaggio delle molecole dal flusso sanguigno al sistema nervoso centrale (SNC) [ 13 ]. La complessa anatomia del cervello ostacola ulteriormente l'accesso a regioni e tipi cellulari specifici [ 22 ]. Di conseguenza, le strategie di somministrazione sistemica convenzionali spesso non riescono a ottenere un'espressione sufficiente nei tessuti cerebrali bersaglio [ 23 , 24 ]. Per ovviare a questo problema, studi precedenti hanno esplorato sia strategie per attraversare la BEE sia vie di somministrazione alternative [ 25 ]. 

Ad esempio, Wang et al. hanno generato una libreria di LNP in grado di attraversare la BEE incorporando piccole molecole mirate al cervello in lipidi ionizzabili, ottenendo un'espressione misurabile ma limitata nel cervello [ 26 ]. Tuttavia, le formulazioni in grado di attraversare la BEE sono limitate dalla bassa efficienza, dall'accumulo sulla superficie corticale e dalla scarsa penetrazione nelle regioni cerebrali più profonde [ 23 , 26 , 27 ]. I metodi di somministrazione localizzata, tra cui l'iniezione intracerebrale (IC) per l'iniezione diretta nel parenchima e l'iniezione intracerebroventricolare (ICV) per la somministrazione mediata dal liquido cerebrospinale (CSF), possono bypassare completamente la barriera emato-encefalica (BBB), consentendo l'accumulo di mRNA nelle regioni cerebrali bersaglio [ 22 , 28 , 29 ]. Sebbene efficaci, queste vie sono intrinsecamente invasive, ponendo una significativa barriera traslazionale [ 13 , 30 ].

La somministrazione intratecale (IT) rappresenta una via alternativa che affronta queste limitazioni. Questa via consente la somministrazione direttamente nel liquido cerebrospinale (CSF), che viene prodotto nei ventricoli cerebrali e circola nello spazio subaracnoideo che circonda il cervello e il midollo spinale [ 13 , 27 , 31 ]. Attraverso lo scambio con il fluido interstiziale del parenchima del SNC, il CSF consente la distribuzione dei farmaci in tutto il SNC, limitando al contempo l'esposizione sistemica [ 31 , 32 ]. 

L'IT è minimamente invasiva, supporta la somministrazione ripetuta ed è già impiegata clinicamente per anestetici, chemioterapici e oligonucleotidi antisenso [ [33] , [34] , [35] , [36] ]. Tuttavia, l'efficiente somministrazione di mRNA al cervello tramite LNP somministrati per via IT non è ancora stata stabilita e rappresenta una sfida chiave per il settore. Un recente studio di Xue et al. hanno presentato lipidi ionizzabili “TD” progettati razionalmente, che hanno ottenuto un’ampia espressione neuronale e astrocitaria nei topi dopo una singola dose IT [ 27 ]. Questi risultati dimostrano la fattibilità ma evidenziano che gli approcci di progettazione razionale, che esplorano solo una regione ristretta dello spazio chimico, hanno avuto un successo limitato a causa dei fattori complessi e poco compresi che regolano la somministrazione al SNC. Per sfruttare questi progressi, è giustificato un approccio di sintesi ad alto rendimento che espanda la diversità dei lipidi ionizzabili per identificare nuove strutture con una maggiore efficienza di somministrazione al SNC.

Qui abbiamo generato una libreria di 200 membri di lipidi ionizzabili biodegradabili utilizzando la reazione a tre componenti di Passerini (P-3CR)[ 37 ], una chimica precedentemente applicata alla sintesi lipidica combinatoria ma non all'editing genomico basato su mRNA o alla somministrazione genica diretta al SNC. Da questa libreria, abbiamo identificato P3B, un lipide capostipite che ha mediato un'efficiente e diffusa somministrazione di mRNA in tutto il cervello dopo la somministrazione IT. Quando formulati con mRNA codificante CRISPR-Cas9, i P3B-LNP hanno ottenuto una robusta trasfezione neuronale e astrocitaria e un efficiente editing genico on-target in vivo , superando le prestazioni del lipide di riferimento clinico DLin-MC3-DMA (MC3). È importante sottolineare che i P3B-LNP hanno anche mediato l'editing on-target della base adenina in vivo , ottenendo un'efficace correzione di singolo nucleotide nel cervello del topo adulto. A nostra conoscenza, questa rappresenta la prima dimostrazione di editing di base non virale nel SNC adulto mediante LNP. Inoltre, i P3B-LNP hanno mantenuto un profilo di sicurezza favorevole con minima esposizione sistemica o attivazione infiammatoria. Nel complesso, questi risultati stabiliscono il P3B come una classe distinta di lipidi ionizzabili biodegradabili che consentono un editing del genoma del SNC efficiente, sicuro e trasferibile tramite somministrazione intratecale di mRNA.

 
Risultati e discussione
Sintesi combinatoria di lipidi ionizzabili tramite P-3CR
Per generare la nostra libreria di lipidi ionizzabili, abbiamo impiegato la reazione a tre componenti di Passerini (P-3CR), una condensazione one-pot di acidi carbossilici (gruppi di testa contenenti ammine terziarie), isocianuri (Coda A) e aldeidi (Coda B) ( Fig. 1a ). Questo approccio consente la creazione combinatoria di lipidi ionizzabili in condizioni blande e senza catalizzatore, ottenendo rese elevate, diversità e biodegradabilità. Rispetto alla sintesi multistep convenzionale o alla progettazione razionale mirata, la P-3CR accelera sia la velocità che la diversità della scoperta di lipidi [ 37 , 38 ]. Inoltre, produce intrinsecamente uno scaffold ammidico α-acilossi contenente un legame estere idrolizzabile, che conferisce biodegradabilità eliminando la necessità di fasi di esterificazione separate. Ciò è particolarmente importante per i materiali mirati al cervello, poiché il tessuto parenchimale è altamente vulnerabile ai danni e alla degenerazione derivanti da stati infiammatori prolungati nel SNC [ 39 , 40 ].

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Progettazione e sintesi di lipidi ionizzabili tramite reazione di Passerini. (a) Panoramica della chimica P-3CR per la sintesi di lipidi ionizzabili in un unico passaggio, la generazione di librerie combinatorie tramite screening ad alto rendimento (HTS) e la formulazione in mRNA-LNP per la somministrazione intratecale (IT) al cervello. (b) Strutture chimiche dei tre costituenti utilizzati per generare la libreria di 200 candidati, tra cui acido carbossilico (gruppo di testa), isocianuro (coda A) e aldeide (coda B). (c) Screening in vivo a più fasi della libreria per la somministrazione di mRNA di luciferasi di lucciola (mFluc) dopo somministrazione intratecale (0,05 mg/kg di mRNA/topo). La fase 1 ha identificato la coda A con le migliori prestazioni, la fase 2 ha identificato la coda B con le migliori prestazioni e la fase 3 ha identificato il gruppo di testa con le migliori prestazioni. n = 3 repliche biologiche. (f) Struttura chimica del lipide principale P3B, identificata combinando TA2, TB5 e H8.
Utilizzando P-3CR, abbiamo sintetizzato una libreria combinatoriale di 200 lipidi per lo screening IT ad alto rendimento ( Fig. 1 a-b). La libreria includeva otto gruppi di testa di acido carbossilico contenenti ammine terziarie (H1-H8), cinque code isocianuro (TA1-TA5) e cinque code aldeidiche (TB1-TB5), che variavano in lunghezza della catena della coda, struttura e saturazione ( Fig. S1-S11 ). 

Convenientemente, lavori precedenti hanno stabilito che il P-3CR genera lipidi con una purezza accettabile per lo screening ad alto rendimento [ 37 ]. I lipidi ionizzabili risultanti sono stati formulati in LNP utilizzando un classico rapporto di formulazione a quattro componenti, contenente 1,2-distearoil- sn -glicero-3-fosfocolina (DSPC) come lipide ausiliario, colesterolo, 1,2-dimiristoil- sn -glicerolo-3-fosfoetanolammina-N-[metossi-(polietilenglicole)-2000] (C14-PEG) e i lipidi ionizzabili sintetizzati dalla libreria P-3CR.

Efficienza di transfezione di P-3CR LNP per la somministrazione al cervello

Per identificare i principali candidati per la somministrazione di mRNA tramite iniezione intratecale (IT), la libreria lipidica P-3CR di 200 membri è stata formulata in LNP incapsulanti mRNA della luciferasi di lucciola (mFluc) e sottoposta a screening in vivo dopo una singola iniezione IT nei topi (Fig. cd). Lo screening diretto in vivo è stato impiegato poiché i sistemi in vitro non riescono a replicare l'ambiente unico del liquido cerebrospinale (CSF) o a riflettere la biodistribuzione degli LNP dopo la somministrazione IT. Tuttavia, per valutare in modo efficiente tutti i 200 LNP in vivo , è stato adottato un approccio di screening basato su batch per determinare l'influenza di ciascun componente (Headgroup, Tail A e Tail B) sull'efficienza di somministrazione al SNC, riducendo al contempo l'uso di animali, i tempi e i costi [ 37 , 41 ]. Nel Round 1, le formulazioni sono state raggruppate in base alla coda isocianuro (Tail A) e somministrate tramite iniezione IT ( Fig. 1c , Fig. S12 ). Due varianti hanno superato le altre: TA2, una catena lineare più corta, e TA5, una catena più lunga contenente un'insaturazione. TA2 ha ottenuto la più alta espressione di mFluc, superando notevolmente le code più lunghe e completamente saturate. Nel Round 2, i lipidi contenenti TA2 sono stati ulteriormente sviluppati e raggruppati in base alla coda aldeidica (Coda B) per un'ulteriore valutazione IT ( Fig. 1d , Fig. S13 ). In questo caso, TB3, che introduce un voluminoso gruppo tert -butile, e TB5, che presenta due legami insaturi, hanno superato le altre varianti della Coda B. TB5 ha ottenuto la più alta espressione di mFluc, sebbene le differenze strutturali tra TB3 e TB5 non abbiano indicato una tendenza coerente nell'intero set. Nel Round 3, con TA2 e TB5 fissi, i LNP sono stati valutati individualmente in base alla struttura del gruppo di testa e somministrati tramite iniezione IT ( Fig. 1e , Fig. S14 ). H8 ha costantemente prodotto la luminescenza più forte nel SNC, mentre H2 e H7 hanno mostrato un'attività intermedia. Questi risultati sono coerenti con lavori precedenti che dimostrano che sottili differenze nella chimica del gruppo di testa possono influenzare fortemente la potenza [ 19 , 42 , 43 ]. La nostra strategia iterativa ha consentito una rapida selezione verso una singola struttura principale, H8TA2TB5, denominata P-3CR-Brain (P3B) ( Fig. 1f ), per un'ulteriore ottimizzazione e benchmarking.

 
Ottimizzazione della formulazione di P3B

Per ottimizzare la potenza di trasfezione del nostro principale lipide ionizzabile P3B, abbiamo implementato una strategia di progettazione degli esperimenti (DOE) che ha valutato sistematicamente cinque parametri di formulazione: (1) rapporto di massa lipide ionizzabile-mRNA, (2) frazione molare di lipide ionizzabile, (3) tipo di fosfolipide, (4) frazione molare di fosfolipide e (5) contenuto di lipidi PEG ( Fig. 2a ) [ 38 , 44 ]. I livelli testati per queste variabili sono mostrati in Fig. 2a e le formulazioni dettagliate sono elencate nelle informazioni di supporto (SI) ( Tabella SI 1 ). Sono state preparate diciotto formulazioni contenenti mFluc e l'efficienza di trasfezione è stata valutata in vivo dopo la somministrazione IT. L'imaging della bioluminescenza ha mostrato differenze marcate nell'intensità del segnale tra le formulazioni ( Fig. 2b ). È importante sottolineare che l'espressione è stata costantemente localizzata nel cervello con un'attività fuori bersaglio trascurabile negli organi periferici, evidenziando uno dei principali vantaggi della somministrazione IT per ottenere una somministrazione mirata al cervello [ 31 , 32 ]. Sia DOE-3 che DOE-7 hanno superato la formulazione originale, con la quantificazione che ha confermato che DOE-3 ha mostrato la maggiore potenza. Questo risultato è stato coerente sia nell'imaging live in vivo che nell'analisi ex vivo di cervelli isolati ( Fig. 2 c-d, Fig. S15 ). Rispetto a DOE-7 (30 mol% P3B), DOE-3 conteneva una frazione lipidica ionizzabile più elevata (60 mol%). Nel contesto della somministrazione IT, ciò suggerisce che l'efficacia è stata migliorata da un contenuto lipidico ionizzabile più elevato, coerente con il ruolo centrale dei lipidi ionizzabili nella stabilizzazione del carico di mRNA e nella facilitazione della fuoriuscita endosomiale [ 45 ]. La formulazione ottimale su misura per P3B è stata definita dai seguenti parametri: rapporto di massa lipide ionizzabile/mRNA 10:1 con composizione molare del lipide P3B al 60%, DOPE al 30% e lipide PEGilato allo 0,5%. Questa formulazione P3B ottimizzata è stata utilizzata in tutti gli esperimenti successivi. L'imaging Cryo-EM delle LNP P3B ottimizzate ha mostrato nanoparticelle sferiche con morfologia uniforme e diametri di ∼ 100 nm, senza aggregazione evidente o strutture irregolari ( Fig. 2f ). Le caratterizzazioni delle LNP, incluso il diametro idrodinamico medio (110 nm) e il PDI (0,108), sono coerenti con LNP ben formate e ne supportano l'idoneità per la somministrazione in vivo [ 46 , 47 ]. Il pKa misurato delle LNP P3B era 6,51 ( Fig. S16 ). Inoltre, studi di stabilità a lungo termine hanno dimostrato che le nanoparticelle lipidiche P3B sono rimaste stabili in PBS fino a 28 giorni a 4 °C ( Fig. S17 ).

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Ottimizzazione della formulazione P3B LNP. (a) Libreria di 18 formulazioni DOE con parametri variabili, contenenti mRNA di mFluc per la somministrazione intratecale, insieme alla formulazione originale (OF). (b) Immagini rappresentative di bioluminescenza dell'intero animale e di organi ex vivo dopo somministrazione intratecale di mFluc-LNP DOE (0,05 mg/kg di mRNA/topo). Immagini rappresentative selezionate da n = 3 repliche biologiche per formulazione, acquisite con impostazioni identiche. (cd) Quantificazione dell'espressione della proteina Fluc nel cervello in vivo ed ex vivo . I dati sono presentati come media ± deviazione standard; n = 3 topi per gruppo (repliche biologiche). (e) Composizione della formulazione P3B ottimizzata (P3B-B). (f) Immagini Cryo-EM di LNP P3B.

Efficacia delle P3B-LNP per la modifica genetica specifica del cervello

Dopo l'ottimizzazione dei P3B-LNP, abbiamo valutato la loro capacità di veicolare un carico funzionale per l'editing genetico al cervello. In linea con gli obiettivi di questo studio, abbiamo valutato i P3B-LNP utilizzando un sistema CRISPR-Cas9 anziché i reporter della ricombinasi Cre comunemente utilizzati negli studi di somministrazione al SNC. Mentre i reporter Cre sono utili per la valutazione iniziale della somministrazione di mRNA, il sistema Cas9/sgRNA rappresenta un carico utile più grande e più difficile da gestire, che consente la misurazione diretta dell'editing genomico funzionale, aspetto fondamentale per stabilire il potenziale terapeutico dei P3B-LNP. A tal fine, abbiamo co-incapsulato l'mRNA di Cas9 insieme a sgTOM, un RNA guida sviluppato per colpire la cassetta di stop fiancheggiata da LoxP nei topi reporter Ai9 ( Fig. 3a ). In condizioni basali, questa cassetta sopprime tdTomato, ma un editing riuscito rimuove la sequenza di stop e attiva l'espressione di tdTomato, fornendo una lettura diretta dell'editing genomico mediato da Cas9 in vivo . I topi Ai9 hanno ricevuto due iniezioni IT di LNP P3B o MC3 formulate con CRISPR-Cas9 (mRNA Cas9/sgTOM) (0,05 mg/kg di mRNA/topo) a distanza di una settimana, e i cervelli sono stati prelevati il ​​giorno 14 per l'analisi ( Fig. 3a ). 

Utilizzando questo sistema, abbiamo mirato a valutare l'efficienza di rilascio di Cas9 da parte di P3B-LNP a neuroni e astrociti in diverse regioni cerebrali ( Fig. 3c ). Rispetto alle LNP MC3, le LNP P3B hanno ottenuto un'espressione di tdTomato robusta e diffusa in tutto il cervello ( Fig. 3b ). In particolare, il rilascio di LNP P3B si è esteso oltre gli strati superficiali fino al tessuto parenchimale profondo, dimostrando un accesso uniforme alle popolazioni cellulari che sono tipicamente inaccessibili con le vie di somministrazione sistemica [ 23 , 26 , 27 ]. L'espressione di TdTomato era evidente nell'ippocampo, nella corteccia e nel talamo, con P3B che superava costantemente MC3 sia nelle popolazioni neuronali che astrocitarie ( Fig. 3 d-f). L'analisi quantitativa ha confermato che P3B-LNP ha raggiunto un'espressione di tdTomato notevolmente più alta rispetto a MC3-LNP in tutte le regioni cerebrali esaminate ( Fig. 3 g-i, S18-21). Nell'ippocampo, P3B-LNP ha trasfettato circa il 19,56% dei neuroni, il 20,21% degli astrociti e il 17,74% della microglia, rappresentando un aumento di circa 2-3 volte rispetto a MC3-LNP. Nella corteccia, le cellule positive per tdTomato hanno raggiunto il 16,93% nei neuroni, il 19,52% negli astrociti e il 12,56% nella microglia; e nel talamo, i P3B-LNP hanno raggiunto il 12,46% di trasfezione neuronale, il 12,65% di trasfezione astrocitaria e il 14,36% di trasfezione microgliale. Tutte le differenze rispetto ai MC3-LNP erano statisticamente significative (P < 0,01). Per il midollo spinale, i P3B-LNP hanno prodotto il 19,14% di neuroni tdTomato + , circa il 22,75% di astrociti tdTomato + e circa il 17,25% di tdTomato +microglia, che erano significativamente più alte del gruppo MC3-LNP (∼7,45%, ∼6,85% e ∼5,61%, rispettivamente; P = 0,0038, 0,0004, 0,0029; Fig. S20 ). L'importanza terapeutica di un'ampia copertura è sottolineata dalla specificità regionale delle malattie del SNC. Ad esempio, la malattia di Alzheimer è caratterizzata da degenerazione ippocampale e corticale [ 48 , 49 ], mentre la malattia di Parkinson coinvolge circuiti talamici disfunzionali che influenzano il controllo motorio [ [50] , [51] , [52] ]. Ottenendo una robusta modifica sia dei neuroni che degli astrociti in queste regioni, i P3B-LNP possono fornire un'ampia portata terapeutica in diverse patologie del SNC.

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P3B -LNP per la somministrazione di mRNA di Cas9 nel modello murino Ai9. (a) Diagramma che illustra la somministrazione di mRNA di Cas9/sgTOM rimuovendo la cassetta di stop fiancheggiata da LoxP per attivare l'espressione di tdTomato nei topi Ai9. (b) Immagini di fluorescenza rappresentative dell'intero cervello di topi Ai9 trattati con MC3-LNP o P3B-LNP incapsulanti Cas9/sgTOM. n = 3 repliche biologiche. (c) Schema che evidenzia le distinte regioni cerebrali analizzate. (df) Espressione di tdTomato in neuroni, astrociti e microglia all'interno dell'ippocampo (d) , della corteccia (e) e del talamo (f) . Immagini rappresentative selezionate da n = 3 topi per gruppo di trattamento (repliche biologiche). Barra di scala: 100 μm. (gi) Quantificazione dei neuroni e degli astrociti positivi a tdTomato nelle tre regioni cerebrali. Per determinare la significatività sono stati utilizzati test t di Student a due code per campioni indipendenti. I dati sono presentati come media ± deviazione standard, n = 3 repliche biologiche.

Le nanoparticelle lipidiche P3B consentono la modifica mediata da ABE nel cervello
Dopo aver stabilito che le P3B LNP trasportano efficacemente l'mRNA/sgRNA di Cas9 al cervello, abbiamo valutato la loro capacità di supportare la modifica genetica mediata dall'editor di basi di adenina (ABE). A differenza dei complessi CRISPR-Cas9, che si basano su rotture a doppio filamento, gli ABE consentono una conversione precisa di singoli nucleotidi, un approccio clinicamente più rilevante per correggere le mutazioni puntiformi che sono alla base di molte malattie neurologiche [ 53 ]. Ad oggi, gli studi in vivo sulla modifica delle basi nel cervello rimangono limitati, con un rapporto che dimostra la somministrazione perinatale di ABE nel cervello tramite iniezione intracerebroventricolare (ICV) per disturbi congeniti [ 54 ]. Tuttavia, non è stata dimostrata una modifica efficiente mediata da ABE nel cervello a seguito di somministrazione IT, una via clinicamente rilevante e meno invasiva.

Per valutare questo, abbiamo impiegato topi reporter LumA (Luminescence ABE), che ospitano una mutazione puntiforme R387X nel gene della luciferasi nel locus ROSA26 che elimina l'attività della luciferasi [ 55 ]. La correzione di successo dell'adenina in guanina (A in G) mediata da ABE nel sito bersaglio ripristina la sequenza codificante e induce l'espressione di Fluc, fornendo una lettura diretta dell'editing di base in vivo . Dopo la somministrazione IT di MC3 o P3B LNP incapsulati con mRNA/sgRNA ABE (0,05 mg/kg mRNA/topo), i risultati dell'editing sono stati monitorati a intervalli di 5 giorni per 20 giorni ( Fig. 4a ). I topi trattati con P3B-LNP hanno mostrato una robusta espressione di Fluc entro il giorno 5 che è persistita fino al giorno 20, in contrasto con l'attività minima osservata con MC3 ( Fig. 4 b-c ). La quantificazione sull'intero organismo ha confermato livelli di Fluc costantemente elevati durante tutto il periodo di 20 giorni, indicando una correzione genomica duratura piuttosto che un'espressione transitoria di Fluc. 

Nel cervello, P3B ha raggiunto un segnale circa 30 volte superiore rispetto al benchmark MC3 ( Fig. 4c ). L'analisi ex vivo ha ulteriormente supportato questa efficienza, con l'espressione di Fluc in gran parte confinata al cervello, suggerendo una bassa incidenza di rilascio fuori bersaglio. In linea con questi risultati, l'analisi a livello tissutale ha rivelato un'espressione diffusa della proteina Fluc in tutto il parenchima cerebrale nei topi trattati con P3B, superando MC3. Per confermare direttamente la modifica a livello del DNA, il sequenziamento del locus Fluc ha verificato la conversione da A a G nel sito bersaglio previsto nei topi trattati con P3B ( Fig. 4e ). La quantificazione ha mostrato che P3B-LNP (14,8%) ha raggiunto un'efficienza di modifica significativamente maggiore rispetto a MC3-LNP (6,9%) ( Fig. 4f ), confermando che l'attivazione di Fluc è derivata da una precisa correzione nucleotidica. Studi di imaging meccanicistico hanno dimostrato che i P3B-LNP presentavano una colocalizzazione lisosomiale sostanzialmente ridotta rispetto agli MC3-LNP, indicando una più efficiente fuga endosomiale e un rilascio citosolico dell'mRNA. Questa maggiore fuga endosomiale, insieme alla penetrazione precedentemente osservata attraverso l'interfaccia CSF-cervello, contribuisce probabilmente alla superiore efficienza di trasfezione del SNC dei P3B-LNP ( Fig. S22-S23 ).

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La somministrazione intratecale (IT) di ABE incapsulato in P3B consente la modifica delle basi cerebrali. (a) Schema dell'attivazione di Fluc mediata da ABE in topi LumA dopo somministrazione intratecale. (b) Immagini rappresentative di bioluminescenza in vivo di topi trattati con PBS, MC3-LNP o P3B-LNP (0,05 mg/kg di mRNA/topo) per 20 giorni. n = 3 repliche biologiche. (c) Quantificazione del segnale Fluc totale nei topi e nel tessuto cerebrale. I dati rappresentano la media ± deviazione standard; n = 3 topi per gruppo (repliche biologiche). Sono stati utilizzati test t di Student non appaiati a due code. (d) Colorazione per immunofluorescenza di sezioni cerebrali che mostrano segnali DAPI (blu) e anti-Fluc (ciano) in topi LumA trattati con PBS, MC3-LNP o P3B-LNP al giorno 20. Immagini rappresentative selezionate da n = 3 topi (repliche biologiche). Barre di scala, 1 mm (sinistra) e 100 µm (destra). (e) Risultati del sequenziamento Sanger che confermano l'editing di base mediato da ABE nel sito bersaglio. (f) Quantificazione dei risultati del sequenziamento Sanger tramite EditR. n = 3 repliche biologiche. I dati rappresentano la media ± deviazione standard; è stato utilizzato il test di confronto multiplo ANOVA a una via.

Nel complesso, questi risultati dimostrano che le nanoparticelle lipidiche P3B (LNP) raggiungono un editing mediato da ABE efficiente e specifico nel cervello dopo la somministrazione intratecale (IT). Questa capacità è significativa perché l'editing delle basi offre un mezzo preciso per correggere le varianti patogene a singolo nucleotide senza introdurre rotture a doppio filamento. Ad esempio, la sindrome di Rett è un disturbo dello sviluppo neurologico in cui oltre il 60% dei casi deriva da mutazioni puntiformi singole nel gene MECP2 , il che la rende un candidato ideale per l'editing delle basi mirato al cervello [ 56 , 57 ]. Combinando un'elevata efficienza con un'attività limitata al cervello, le nanoparticelle lipidiche P3B somministrate per via intratecale rappresentano una piattaforma promettente per far progredire l'editing terapeutico delle basi.

 
Sicurezza e tollerabilità delle nanoparticelle lipidiche P3B

La tollerabilità dei materiali mirati al cervello è fondamentale, poiché il parenchima del SNC è altamente vulnerabile a lesioni e degenerazione causate da stati infiammatori prolungati [ 39 , 40 ]. Per valutare la sicurezza delle LNP P3B dopo la somministrazione IT, il plasma è stato raccolto a 6 e 24 ore dopo l'iniezione per la profilazione dei biomarcatori infiammatori. Rispetto alle LNP MC3, che hanno innescato un'ampia sovraregolazione di citochine e chemochine, le P3B hanno suscitato una risposta più debole, con livelli inferiori di marcatori chiave tra cui interleuchina-1 beta (IL-1β), interleuchina 6 (IL-6), fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α), interferone gamma (IFN-γ) e chemochine come CXCL1, CCL2 e CCL3 ( Fig. 5a ). In particolare, molti marcatori sono stati soppressi al di sotto del livello basale nei topi trattati con P3B, in contrasto con la forte attivazione osservata con MC3. A 24 ore dall'iniezione, i livelli dei biomarcatori nel gruppo P3B erano in gran parte tornati ai valori di controllo PBS, indicando un elevato livello di tollerabilità ( Fig. 5a ). Per valutare la funzionalità epatica, sono stati misurati i livelli plasmatici di alanina aminotransferasi (ALT) e aspartato aminotransferasi (AST) a 6 e 24 ore dall'iniezione. Non sono state osservate variazioni significative tra i gruppi ( Fig. 5 b-c), il che indica che le nanoparticelle lipidiche P3B non causano tossicità epatica rilevabile. L'esame istopatologico degli organi principali, tra cui cervello, fegato, cuore, milza, polmoni e reni, non ha rivelato alcuna evidenza di danno tissutale o infiammazione a 6 ore dall'iniezione ( Fig. 5d ). Nel complesso, questi risultati dimostrano che le nanoparticelle lipidiche P3B sono ben tollerate e presentano un profilo di sicurezza favorevole per la somministrazione di mRNA al cervello tramite somministrazione intratecale. Questa biocompatibilità è coerente con i principi di progettazione dei lipidi derivati ​​da Passerini, che presentano impalcature ammidiche α-acilossi con legami esterei idrolizzabili [ 37 ]. Questi legami promuovono la biodegradazione e la clearance, minimizzando così i potenziali effetti avversi associati all'accumulo di lipidi [ 45 , 58 , 59 ]. I test di stabilità metabolica utilizzando microsomi epatici di topo hanno ulteriormente confermato che P3B subisce la scissione enzimatica del legame estere derivato da Passerini, producendo tre metaboliti identificabili coerenti con la sua biodegradabilità progettata ( Fig. S24 ). Nel complesso, questi risultati dimostrano che le LNP P3B sono ben tollerate e presentano un profilo di sicurezza favorevole per la somministrazione intratecale di mRNA al cervello. Sebbene questi risultati stabiliscano un'eccellente tollerabilità acuta, la principale limitazione risiede nella finestra di valutazione di 24 ore. Sebbene questi dati abbiano confermato un'attivazione immunitaria minima, sono in corso studi completi a lungo termine che prevedono somministrazioni ripetute e monitoraggio longitudinale per valutare ulteriormente la sicurezza cronica, comprese le potenziali alterazioni neuroinfiammatorie e istopatologiche.

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Valutazione della sicurezza delle nanoparticelle lipidiche P3B in vivo dopo somministrazione intratecale (IT). (a) Mappe di calore che mostrano l'espressione di citochine e chemochine nel cervello dei topi 6 o 24 ore dopo l'iniezione IT di nanoparticelle lipidiche P3B o MC3 (0,05 mg/kg di mRNA/topo), rispetto ai controlli PBS. (b) Livelli plasmatici di alanina transaminasi (ALT) e aspartato transaminasi (AST) 6 o 24 ore dopo l'iniezione IT. (d) Immagini istopatologiche rappresentative degli organi principali (cervello, fegato, cuore, milza, polmone, rene) raccolti 6 ore dopo l'iniezione IT (0,05 mg/kg di mRNA/topo) di nanoparticelle lipidiche MC3 o P3B. Barre di scala, 100 μm. Tutti i dati provengono da n = 3 repliche biologiche e sono presentati come media ± deviazione standard. La significatività statistica e i valori P sono stati determinati mediante test di confronto multiplo ANOVA a una via. ns, non significativo, P > 0,05.

Conclusione

In questo studio, abbiamo sfruttato un approccio di sintesi e screening lipidico ad alto rendimento basato sulla reazione di Passerini per identificare lipidi ionizzabili ottimizzati per la somministrazione di editor genici basati su mRNA al sistema nervoso centrale (SNC) tramite somministrazione intratecale. Da una libreria di 200 membri, abbiamo scoperto P3B, un lipide ionizzabile biodegradabile che consente una somministrazione efficiente e diffusa di editor genici in tutto il cervello. Le formulazioni ottimizzate di P3B-LNP hanno ottenuto una robusta modifica del genoma mediata da Cas9 sia nei neuroni che negli astrociti in diverse regioni cerebrali, tra cui l'ippocampo, la corteccia e il talamo, evidenziando il loro ampio potenziale per il trattamento dei disturbi del SNC. Inoltre, i P3B-LNP hanno supportato una modifica precisa della base adenina, dimostrando la loro capacità di correzione mirata delle mutazioni a singolo nucleotide alla base di molte malattie neurologiche. In tutte le applicazioni, P3B ha superato il benchmark clinico MC3. È importante sottolineare che le P3B-LNP si sono dimostrate biodegradabili e ben tollerate, con un'esposizione sistemica minima e risposte infiammatorie attenuate, a supporto del loro potenziale per una somministrazione ripetuta e sicura. Questo lavoro evidenzia la potenza della progettazione combinatoria dei lipidi nel promuovere l'editing genomico mirato al sistema nervoso centrale e fornisce una piattaforma versatile per perfezionare la chimica dei lipidi al fine di affrontare le sfide specifiche di somministrazione di editor genici basati su mRNA, di grandi dimensioni e complessi. Gli sforzi futuri si concentreranno sulla valutazione dell'efficacia terapeutica e della sicurezza a lungo termine dell'editing genico in modelli rilevanti per le malattie del sistema nervoso centrale.

Materiali e metodi

Libreria lipidica e sintesi di lipidi ionizzabili
I lipidi ionizzabili sono stati sintetizzati utilizzando la reazione a tre componenti di Passerini (P-3CR), che accoppia acidi carbossilici, aldeidi e isocianuri in rapporti equimolari (1:1:1) in diclorometano[ 37 ]. Le reazioni sono state eseguite in piastre PCR sigillate a 96 pozzetti in condizioni ambientali per 24 ore. I solventi sono stati rimossi mediante essiccazione sotto vuoto e i lipidi grezzi sono stati risospesi in etanolo per lo screening ad alto rendimento. I lipidi grezzi sono stati purificati mediante cromatografia flash (BUCHI). Le strutture dei lipidi sintetizzati sono state confermate mediante spettroscopia NMR del protone (1H NMR) a 400 MHz (spettrometro Bruker).

formulazione LNP
Le LNP sono state preparate miscelando una fase lipidica etanolica con una soluzione acquosa di mRNA in un dispositivo microfluidico a giunzione a T. Dopo la miscelazione, le particelle sono state dializzate contro PBS (cassetta 10.000 MWCO, Thermo Fisher) per 12 ore a 4 °C. La fase lipidica conteneva lipidi ionizzabili, DSPC (Avanti), colesterolo (Avanti) e C14-PEG2000 (Avanti) in rapporti molari di 50:10:38,5:1,5, analogamente alle formulazioni MC3. MC3 è stato ottenuto da Echelon Bioscience. La fase acquosa era costituita da mRNA disciolto in tampone citrato 10 mM (pH 4,0). Le sospensioni finali di LNP contenevano 0,1 µg/µL di mRNA.

L'ottimizzazione della formulazione è stata eseguita per valutare cinque variabili chiave che influenzano l'efficienza di trasfezione e incapsulamento delle LNP: (1) rapporto di massa lipidi ionizzabili/mRNA, (2) frazione molare di lipidi ionizzabili, (3) tipo di fosfolipide, (4) frazione molare di fosfolipidi e (5) contenuto di PEG-lipidi. I progetti sperimentali sono stati generati utilizzando il software JMP13 (SAS Institute).

Caratterizzazione di LNP
Il diametro idrodinamico e l'indice di polidispersione (PDI) delle LNP sono stati determinati mediante diffusione dinamica della luce (DLS) su uno Zetasizer Malvern Nano ZS. Le sospensioni di LNP sono state diluite in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4) alla concentrazione di mRNA appropriata e caricate in cuvette monouso. Le misurazioni sono state effettuate a 25 °C con un tempo di esecuzione di 2 s per misurazione e lo strumento è stato impostato per regolare automaticamente il numero di misurazioni e l'attenuazione. Le distribuzioni delle dimensioni delle particelle sono state riportate come diametri medi Z.

La concentrazione di mRNA e l'efficienza di incapsulamento sono state quantificate utilizzando il kit di analisi RNA Quant-iT RiboGreen (Invitrogen). Per determinare l'efficienza di incapsulamento, sono state effettuate due misurazioni. In primo luogo, è stata misurata la fluorescenza utilizzando LNP intatti, che riflette la quantità di RNA non incapsulato (libero) poiché RiboGreen non può penetrare le membrane lipidiche. In secondo luogo, gli stessi campioni sono stati trattati con Triton X-100 all'1% per rompere gli LNP e rilasciare l'RNA incapsulato, fornendo il segnale dell'RNA totale. L'efficienza di incapsulamento è stata calcolata come (RNA totale − RNA libero) / RNA totale × 100 %.

Esperimenti sugli animali
Tutte le procedure sperimentali sono state approvate eticamente e tutti gli studi sugli animali sono stati approvati e condotti in conformità con le linee guida dell'Animal Resources Centre dell'University Health Network. Topi femmina (da 6 a 8 settimane) BALB/C, B6. Cg-Gt (ROSA) 26Sortm9(CAG-tdTomato) Hze /J (Ai9) e C57BL/6J-Gt (ROSA)26Sorem1Crx /J (LumA) sono stati ottenuti dal Jackson Laboratory.
Test in vivo basati su lotti

Per i test batch in vivo , le miscele di LNP all'interno di ciascuna classe strutturale sono state raggruppate, dializzate e somministrate per via intratecale ai topi. Successivamente, è stata utilizzata una dose uniforme di 0,05 mg/kg di mFluc-LNP in tutte le fasi: 25 miscele per gruppo nell'analisi batch del primo ciclo, 5 miscele per gruppo nel secondo ciclo e singole formulazioni nel terzo ciclo. A 6 ore dall'iniezione, i topi sono stati sottoposti al test di bioluminescenza utilizzando un sistema di imaging in vivo (sistema di imaging cinetico IVIS, Perkin Elmer).

Analisi della bioluminescenza
Topi BALB/c (6-8 settimane, 20 ± 2 g) sono stati iniettati per via intratecale con mFluc-LNP (0,05 mg/kg). Sei ore dopo la somministrazione, gli animali hanno ricevuto un'iniezione intraperitoneale di D-luciferina (0,2 mL, 10 mg/mL in DPBS; PerkinElmer). Dopo 10 minuti, i topi sono stati anestetizzati con isoflurano all'1,5% in ossigeno e sottoposti a imaging utilizzando un sistema IVIS (PerkinElmer). I cervelli sono stati quindi prelevati per l'imaging ex vivo e i segnali di luminescenza sono stati quantificati utilizzando il software Living Image (PerkinElmer).

Microscopia elettronica a trasmissione criogenica di LNP
Sospensioni concentrate di LNP (10–20 mg/mL di lipidi) sono state applicate in piccole gocce su griglie di rame rinforzate con carbonio e rivestite di polimero, tamponate con carta da filtro per formare film sottili e vetrificate in etano liquido a −180 °C. Le griglie sono state preparate immediatamente prima dell'imaging e mantenute al di sotto di −165 °C. I campioni sono stati analizzati con un microscopio elettronico a trasmissione FEI Tecnai F20 (Thermo Fisher Scientific, 200 kV) dotato di un rivelatore Gatan K2 Summit. Le immagini sono state acquisite a un ingrandimento di 25.000× in modalità di conteggio (dimensione del pixel 1,45 Å; ∼5 e − /pixel/s) con raccolta automatizzata (software EPU). L'analisi delle immagini è stata eseguita utilizzando iTEM (Olympus) e le distribuzioni delle dimensioni delle particelle sono state calcolate da ≥ 3 immagini di alta qualità per campione, con > 100 particelle analizzate per ciascuna formulazione.

mRNA e RNA guida singolo (sgRNA)
L'mRNA ABE8e-SpRY è stato generato linearizzando i plasmidi ABE con NdeI (NEB, #R0111), purificando i frammenti di DNA con il kit FastPure Gel Extraction (Vazyme, #DC301) ed eseguendo la trascrizione in vitro utilizzando il kit HiScribe T7 RNA Synthesis (NEB, #E2040) con N1-metil-pseudouridina-5′-trifosfato (SyngeneBio) in sostituzione dell'UTP. I trascritti sono stati cappati utilizzando l'enzima capping del Faustovirus (NEB, #M2081) e la 2′-O-metiltransferasi (NEB, #M0366), seguiti da poliadenilazione con la poli(A) polimerasi di E. coli (NEB, #M0276). I prodotti finali sono stati purificati, quantificati con NanoDrop e portati a una concentrazione di 1 µg/µL per l'incapsulamento in LNP. Gli mRNA completamente modificati codificanti Fluc (TriLink, #L-7602), Cre (TriLink, #L-7603) e Cas9 (TriLink, #L-8106), con chimica CleanCap m6AG 3′OMe, sono stati acquistati da TriLink. Gli sgRNA con modifiche 2′-O-metil e fosforotioato nei primi e negli ultimi tre nucleotidi sono stati ottenuti da IDT, con le sequenze fornite nella Tabella supplementare 2.

Modifica genetica nei topi reporter Ai9 e LumA.
I topi Ai9 hanno ricevuto iniezioni intratecali settimanali di LNP contenenti mCas9 e sgTOM (rapporto molare 3:1; dose totale di RNA, 0,05 mg/kg per topo) per due settimane consecutive. I cervelli sono stati prelevati una settimana dopo l'ultima iniezione per le analisi successive.
Ai topi LumA sono state somministrate iniezioni intratecali di LNP contenenti mABE e sgRNA (rapporto 1:1; 0,05 mg/kg per topo) il giorno 0, per un totale di tre dosi. L'attività della luciferasi è stata monitorata mediante imaging IVIS per 16 giorni, dopodiché i topi sono stati sacrificati e sono stati prelevati cervelli e organi principali per l'analisi della luminescenza.

I tessuti raccolti sono stati fissati in PFA al 4% e processati presso la struttura STTARR (UHN) per il sezionamento, la colorazione e l'imaging.

Isolamento e colorazione delle cellule per la citometria a flusso
I cervelli prelevati sono stati digeriti in DMEM privo di siero contenente collagenasi IV (BioShop) per 1 ora a 37 °C e filtrati attraverso un setaccio da 70 µm per ottenere sospensioni di cellule singole. Un milione di cellule per campione sono state trasferite in provette da 1,5 mL e colorate con il colorante di vitalità Zombie NIR (1:1000, BioLegend). Le cellule sono state quindi bloccate con BSA all'1%/FBS all'1% e incubate con anticorpi anti-NeuN e anti-GFAP (BioLegend) secondo le istruzioni del produttore. Infine, le cellule sono state fissate in PFA al 4% e analizzate mediante citometria a flusso.

Analisi dei dati
Le analisi statistiche sono state condotte utilizzando GraphPad Prism 9. Per determinare la significatività sono stati utilizzati test t di Student a due code per campioni indipendenti. I dati sono presentati come media ± deviazione standard, con i livelli di significatività indicati come: *P < 0,01, **P < 0,01, ***P < 0,001 e ****P < 0,0001.

Contributi degli autori
SD, LH e BL hanno ideato lo studio e progettato gli esperimenti. SD, LH, FG, YX, YC, NCS, JC, MZ, TT, MS, S. L, YZ e TH hanno eseguito gli esperimenti e l'analisi dei dati. SD, LH e BL hanno scritto e revisionato l'articolo. BL ha ottenuto i finanziamenti e supervisionato il progetto. Tutti gli autori hanno fornito feedback e contribuito a dare forma alla ricerca, all'analisi dei dati e all'articolo.

Dichiarazione di contributo autoriale CRediT
Songtao Dong: Redazione – revisione e modifica, Redazione – bozza originale, Curatela dei dati, Concettualizzazione. Lauren Healy: Redazione – revisione e modifica, Redazione – bozza originale, Curatela dei dati, Concettualizzazione. Fanglin Gong: Curatela dei dati. Yue Xu: Curatela dei dati. Yunshu Cai: Curatela dei dati. Nicholas C. Solek: Curatela dei dati. Jingan Chen: Curatela dei dati. Muye Zhou: Curatela dei dati. Tyler Thomson: Curatela dei dati. Margarita Savguira: Curatela dei dati. Sijin Luozhong: Curatela dei dati. Yanchao Zhang: Curatela dei dati. Tingzhen He: Curatela dei dati. Gen Li: Curatela dei dati. Bowen Li: Redazione – revisione e modifica, Acquisizione di finanziamenti, Concettualizzazione.

Dichiarazione di conflitto di interessi
Gli autori dichiarano i seguenti interessi finanziari/relazioni personali che potrebbero essere considerati come potenziali conflitti di interesse: Bowen Li dichiara di aver ricevuto un finanziamento dall'Università di Toronto. Gli altri autori dichiarano di non avere interessi finanziari o relazioni personali noti che potrebbero aver influenzato il lavoro riportato in questo articolo.

Riconoscimento
Gli autori ringraziano lo staff di STTARR e ARC presso l'University Health Network per l'assistenza fornita nella sperimentazione animale.
Questo lavoro è stato supportato dalla Cattedra GSK, dal fondo di avviamento della Facoltà di Farmacia Leslie Dan , dal Consiglio di ricerca in scienze naturali e ingegneria del Canada (n. RGPIN-2023-05124 ), dal Programma delle Cattedre di Ricerca del Canada (n. CRC-2022-00575 ), dagli Istituti canadesi di ricerca sanitaria (nn. PJH-185722 , PJT-190109 , PJT -192011 , PJT-195669 ), dal Fondo Connaught (n. 514681 ), dalla Fondazione JP Bickell (n. 515159 ), dal Fondo New Frontiers in Research-Exploration ( NFRFE-2023-00203 ), dalle sovvenzioni dei National Institutes of Health ( 1R01HL174773 ) e dalla Fondazione canadese per l'innovazione-Fondo John R. Evans Leaders (n. 43711).

Appendice A. Dati supplementari
Di seguito sono riportati i dati supplementari relativi a questo articolo:Scarica: Scarica il documento Word (19 MB)

Dati supplementari 1 .

Disponibilità dei dati
I dati saranno resi disponibili su richiesta.

Riferimenti[1]
S. Qin , X. Tang , Y. Chen , K. Chen , N. Fan , W. Xiao , Q. Zheng , G. Li , Y. Teng , M. Wu , X. Song , S. Qin , X. Tang , Y. Chen , K. Chen , N. Fan , W. Xiao , Q. Zheng , G. Li , Y. Teng , M. Wu , X. Song
Terapie basate sull'mRNA: strumenti potenti e versatili per combattere le malattie
Trasduzione del segnale e terapia mirata , 7 ( 2022 ) , pp . 1-7
Google Scholar
[2]
MM Żak , L. Zangi
Sviluppo clinico di applicazioni terapeutiche a base di mRNA.
Mol. Ther. , 33 ( 2025 ) , pp. 2583 - 2609
Visualizza PDFVisualizza l'articolo Visualizza in ScopusGoogle Scholar
[3]
N. Chaudhary , D. Weissman , KA Whitehead , N. Chaudhary , D. Weissman , KA Whitehead
Vaccini a mRNA contro le malattie infettive: principi, modalità di somministrazione e applicazione clinica.
Nat . Rev. Drug Discovery , 20 ( 2021 ) , pp . 11-20
Visualizza in ScopusGoogle Scholar
[4]
JD Beck , D. Reidenbach , N. Salomon , U. Sahin , Ö. Türeci , M. Vormehr , LM Kranz
Terapie a base di mRNA nell'immunoterapia del cancro
Mol. Cancer , 20 ( 2021 ) , p. 69
Visualizza in ScopusGoogle Scholar
[5]
C. Krienke , L. Kolb , E. Diken , M. Streuber , S. Kirchhoff , T. Bukur , Ö. Akilli-Öztürk , LM Kranz , H. Berger , J. Petschenka , M. Diken , S. Kreiter , N. Yogev , A. Waisman , K. Karikó , Ö. Türeci , U. Sahin
Un vaccino a mRNA non infiammatorio per il trattamento dell'encefalomielite autoimmune sperimentale
Scienza , 371 ( 2021 ) , pp . 145-153
Visualizza Crossref in ScopusGoogle Scholar
[6]
M. Savguira , DXW Chen , S. Dong , B. Li
Immunoterapia a base di RNA: una rivoluzione nel trattamento del cancro e delle malattie autoimmuni
Trends Mol. Med. ( 2025 )
Google Scholar
[7]
PS Kowalski , A. Rudra , L. Miao , DG Anderson
Consegnare il messaggero: progressi nelle tecnologie per la somministrazione terapeutica di mRNA
Mol. Ther. , 27 ( 2019 ) , pp. 710 - 728
Visualizza PDFVisualizza l'articoloGoogle Scholar
[8]
A. Magadum , K. Kaur , L. Zangi
Terapia di sostituzione proteica basata sull'mRNA per il cuore
Mol. Ther. , 27 ( 2019 ) , pp. 785 - 793
Visualizza PDFVisualizza l'articolo Visualizza in ScopusGoogle Scholar
[9]
S. Ramaswamy , N. Tonnu , K. Tachikawa , P. Limphong , JB Vega , PP Karmali , P. Chivukula , IM Verma
Somministrazione sistemica di RNA messaggero del fattore IX per la terapia di sostituzione proteica
Proc. Natl. Acad. Sci. , 114 ( 2017 ) , pp. E1941 - E1950
Visualizza in ScopusGoogle Scholar
[10]
Q. Cheng , T. Wei , L. Farbiak , LT Johnson , SA Dilliard , DJ Siegwart
Nanoparticelle per il targeting selettivo degli organi (SORT) per la somministrazione di mRNA tessuto-specifico e la modifica genetica tramite CRISPR-Cas
Nat. Nanotechnol. , 15 ( 2020 ) , pp. 313 - 320
Visualizza Crossref in ScopusGoogle Scholar
[11]
A. Mohammadian Farsani , N. Mokhtari , S. Nooraei , H. Bahrulolum , A. Akbari , ZM Farsani , S. Khatami , MS Ebadi , G. Ahmadian
Nanoparticelle lipidiche: la svolta nell'editing genomico con CRISPR-Cas9
Heliyon , 10 ( 2024 ) , articolo e24606
Visualizza PDFVisualizza l'articolo Visualizza in ScopusGoogle Scholar
[12]
F. Duarte , N. Déglon
Modifica del genoma per i disturbi del sistema nervoso centrale
Front. Neurosci. , 14 ( 22 ottobre 2020 )
Google Scholar
[13]
J. Gao, S. Gunasekar, ZJ Xia, K. Shalin, C. Jiang, H. Chen, D. Lee, S. Lee, ND Pisal, JN Luo, A. Griciuc, JM Karp, R. Tanzi, N. Joshi, J. Gao, S. Gunasekar, ZJ Xia, K. Shalin, C. Jiang, H. Chen, D. Lee, S. Lee, ND Pisal, JN Luo, A. Griciuc, JM Karp, R. Tanzi, N. Joshi, Terapia genica per i disturbi del SNC: modalità, somministrazione e sfide traslazionali, Nature Reviews Neuroscience 2024 25:8-25.
Google Scholar
[14]
J. Sun, S. Roy, J. Sun, S. Roy, Terapie geniche per le malattie neurodegenerative, Nature Neuroscience 2021 24:3-24.
Google Scholar
[15]
JB Li , GM Church
Decifrare le funzioni e la regolazione dell'editing dell'RNA da A a I arricchito nel cervello
Nat. Neurosci. , 16 ( 2013 ) , pp. 1518 - 1522
Crossref Visualizza in Scopus Google Scholar
[16]
X. Hou , T. Zaks , R. Langer , Y. Dong
Nanoparticelle lipidiche per la somministrazione di mRNA
Naz. Rev. Mater. , 6 ( 2021 ) , pp. 1078 - 1094
Crossref Visualizza in Scopus Google Scholar
[17]
OS Fenton , KJ Kauffman , JC Kaczmarek , RL McClellan , S. Jhunjhunwala , MW Tibbitt , MD Zeng , EA Appel , JR Dorkin , FF Mir , JH Yang , MA Oberli , MW Heartlein , F. DeRosa , R. Langer , DG Anderson
Sintesi e valutazione biologica di materiali lipidici ionizzabili per la somministrazione in vivo di RNA messaggero ai linfociti B.
Adv. Mater. , 29 ( 2017 ) , Articolo 1606944
Visualizza in Scopus Google Scholar
[18]
S. Nie , B. Yang , R. Ma , L. Zha , Y. Qin , L. Ou , X. Chen , L. Li
Nanomateriali sintetici per il rilascio di mRNA specifico per la milza
Biomateriali , 314 ( 2025 ) , Articolo 122859
Visualizza PDFVisualizza l'articolo Visualizza in Scopus Google Scholar
[19]
L. Healy , BY Seto , H. Cui , B. Li
Somministrazione non virale di mRNA ai polmoni
Biomater. Sci. , 13 ( 2025 ) , pp. 2871 - 2882
Crossref Visualizza in Scopus Google Scholar
[20]
DO Popoola , Z. Cao , Y. Men , X. Li , M. Viapiano , S. Wilkens , J. Luo , Y. Teng , Q. Meng , Y. Li
Rilascio di mRNA specifico per i polmoni reso possibile da nanoparticelle lipidiche di sulfonio
Nano Lett. , 24 ( 2024 ) , pp. 8080 - 8088
Crossref Visualizza in Scopus Google Scholar
[21]
M. Qiu , Y. Tang , J. Chen , R. Muriph , Z. Ye , C. Huang , J. Evans , EP Henske , Q. Xu
Somministrazione selettiva di mRNA a livello polmonare tramite nanoparticelle lipidiche sintetiche per il trattamento della linfangioleiomiomatosi polmonare
Proc. Natl. Acad. Sci. , 119 ( 2022 ) , Articolo e2116271119
Visualizza in Scopus Google Scholar
[22]
E. Nance , SH Pun , R. Saigal , DL Sellers , E. Nance , SH Pun , R. Saigal , DL Sellers
Somministrazione di farmaci al sistema nervoso centrale
Naz. Rev. Mater. , 7 ( 2021 ) , pp. 4 - 7
Google Scholar
[23]
Z. Liu, Y. Zhang, H. Li, K. Guo, M. Tian, ​​D. Cao, DD Kang, Y. Xue, X. Hou, C. Wang, S. Wang, Y. Zhong, C. Yu, B. Deng, DW McComb, Y. Dong, Nanoparticelle lipidiche derivate dal furano per il trasporto di mRNA al sistema nervoso centrale, Journal of the American Chemical Society, 147.
Google Scholar
[24]
B. Xiong , Y. Wang , Y. Chen , S. Xing , Q. Liao , Y. Chen , Q. Li , W. Li , H. Sun
Strategie per la modificazione strutturale di piccole molecole al fine di migliorare la penetrazione della barriera emato-encefalica: una prospettiva recente
J.Med. Chimica. , 64 ( 2021 ) , pp. 13152 - 13173
Visualizza l'articolo Crossref Visualizza in Scopus Google Scholar
[25]
C. Saraiva , C. Praça , R. Ferreira , T. Santos , L. Ferreira , L. Bernardino
Somministrazione di farmaci al cervello tramite nanoparticelle: superare la barriera emato-encefalica per il trattamento delle malattie neurodegenerative.
J. Control. Release , 235 ( 2016 )
Google Scholar
[26]
C. Wang , Y. Xue , T. Markovic , H. Li , S. Wang , Y. Zhong , S. Du , Y. Zhang , X. Hou , Y. Yu , Z. Liu , M. Tian , ​​DD Kang , L. Wang , K. Guo , D. Cao , J. Yan , B. Deng , DW McComb , RE Parsons , AM Minier-Toribio , LM Holt , J. Pan , A. Hashemi , BH Kopell , AW Charney , EJ Nestler , PC Peng , Y. Dong , C. Wang , Y. Xue , T. Markovic , H. Li , S. Wang , Y. Zhong , S. Du , Y. Zhang , X. Hou , Y. Yu , Z. Liu , M. Tian , DD Kang , L. Wang , K. Guo , D. Cao , J. Yan , B. Deng , DW McComb , RE Parsons , AM Minier-Toribio , LM Holt , J. Pan , A. Hashemi , BH Kopell , AW Charney , EJ Nestler , PC Peng , Y. Dong
Nanoparticelle lipidiche in grado di attraversare la barriera emato-encefalica per il rilascio di mRNA nel sistema nervoso centrale.
Nat. Mater. ( 2025 )
Google Scholar
[27]
Y. Xue , C. Wang , H. Li , S. Du , Y. Zhong , Y. Zhang , S. Wang , K. Guo , X. Hou , DD Kang , Z. Liu , M. Tian , ​​D. Cao , B. Deng , DW McComb , T. Markovic , J. Pan , M. Borna , EJ Nestler , PC Peng , Y. Dong
Le nanoparticelle lipidiche migliorano il rilascio di mRNA nel sistema nervoso centrale in seguito a iniezione intratecale.
Adv. Mater. , 37 ( 2025 )
Google Scholar
[28]
DS Hersh , AS Wadajkar , N. Roberts , JG Perez , NP Connolly , V. Frenkel , JA Winkles , GF Woodworth , AJ Kim
Strategie di somministrazione di farmaci in evoluzione per superare la barriera emato-encefalica
Curr. Pharm. Des. , 22 ( 2016 ) , pp. 1177 - 1193
Visualizza in Scopus Google Scholar
[29]
J. Tuma , Y.-J. Chen , MG Collins , A. Paul , J. Li , H. Han , R. Sharma , N. Murthy , HY Lee
Le nanoparticelle lipidiche trasportano l'mRNA al cervello dopo un'iniezione intracerebrale.
Biochimica , 62 ( 20 settembre 2023 )
Google Scholar
[30]
SK Niazi
Somministrazione non invasiva di farmaci attraverso la barriera emato-encefalica: un'analisi prospettica
Farmaceutica , 15 ( 2023 )
Google Scholar
[31]
KT Householder, S. Dharmaraj, DI Sandberg, RJ Wechsler-Reya, RW Sirianni, KT Householder, S. Dharmaraj, DI Sandberg, RJ Wechsler-Reya, RW Sirianni, Destino delle nanoparticelle nel sistema nervoso centrale dopo iniezione intratecale in topi sani, Scientific Reports 2019 9:1-9.
Google Scholar
[32]
SS Sadekar , M. Bowen , H. Cai , S. Jamalian , H. Rafidi , W. Shatz-Binder , J. Lafrance-Vanasse , P. Chan , WJ Meilandt , A. Oldendorp , A. Sreedhara , A. Daugherty , S. Crowell , KR Wildsmith , J. Atwal , RN Fuji , J. Horvath
Approcci traslazionali per la somministrazione di farmaci biologici al cervello tramite il liquido cerebrospinale
Clinica Farmacologica Terapeutica , 111 ( 2022 ) , pp . 826-834
Crossref Visualizza in Scopus Google Scholar
[33]
MA Capozza e altri
Revisione narrativa della somministrazione intratecale di farmaci (IDD): indicazioni, dispositivi e potenziali complicanze
Anna. Trad. Med. , 9 ( 2021 ) , pag. 186
Crossref Google Scholar
[34]
S. Triarico , P. Maurizi , S. Mastrangelo , G. Attinà , MA Capozza , A. Ruggiero
Migliorare la somministrazione di farmaci chemioterapici al cervello nei tumori cerebrali infantili
Tumori (Basilea) , 11 ( 2019 )
Google Scholar
[35]
P. Calias , W.A. Banks , D. Begley , M. Scarpa , P. Dickson
Somministrazione intratecale di terapie proteiche al cervello: una rivalutazione critica
Farmacologia Terapeutica , 144 ( 2014 )
Google Scholar
[36]
EE Neil , EK Bisaccia
Nusinersen: un nuovo oligonucleotide antisenso per il trattamento dell'atrofia muscolare spinale
J. Pediatr. Pharmacol. Ther. , 24 ( 2019 ) , pp. 194 - 203
Crossref Visualizza in Scopus Google Scholar
[37]
Y. Xu e altri
Progettazione razionale e sintesi modulare di lipidi ionizzabili biodegradabili tramite la reazione di Passerini per la somministrazione di mRNA.
Proc. Natl. Acad. Sci. , 122 ( 2025 ) , Articolo e2409572122
Visualizza in Scopus Google Scholar
[38]
J. Chen , Y. Xu , M. Zhou , S. Xu , AJ Varley , A. Golubovic , RXZ Lu , KC Wang , M. Yeganeh , D. Vosoughi , B. Li
Progettazione combinatoria di nanoparticelle lipidiche ionizzabili per il rilascio selettivo di mRNA nel tessuto muscolare con effetti fuori bersaglio minimizzati.
Proc. Natl. Acad. Sci. , 120 ( 2023 ) , Articolo e2309472120
Visualizza in Scopus Google Scholar
[39]
T. Chen , Y. Dai , C. Hu , Z. Lin , S. Wang , J. Yang , L. Zeng , S. Li , W. Li
Meccanismi cellulari e molecolari della disfunzione della barriera emato-encefalica nelle malattie neurodegenerative
Barriere dei fluidi SNC , 21 ( 2024 ) , p. 60
Visualizza in Scopus Google Scholar
[40]
A. Adamu , S. Li , F. Gao , G. Xue
Il ruolo della neuroinfiammazione nelle malattie neurodegenerative: stato attuale delle conoscenze e futuri obiettivi terapeutici.
Front. Aging Neurosci. , 16 ( 2024 ) , Articolo 1347987
Visualizza in Scopus Google Scholar
[41]
B. Li , AY Jiang , I. Raji , C. Atyeo , TM Raimondo , AGR Gordon , LH Rhym , T. Samad , C. MacIsaac , J. Witten , H. Mughal , TM Chicz , Y. Xu , RP McNamara , S. Bhatia , G. Alter , R. Langer , DG Anderson
Miglioramento dell'immunogenicità dei vaccini mRNA a base di nanoparticelle lipidiche mediante l'adiuvamento del lipide ionizzabile e dell'mRNA
Nat. Biomed. Eng. , 9 ( 2025 ) , pp. 167 - 184
Google Scholar
[42]
D. Sun , ZR Lu
Struttura e funzione dei lipidi cationici e ionizzabili per il rilascio di acidi nucleici.
Ricerca farmaceutica , 40 ( 2023 ) , pp . 27-46
Crossref Google Scholar
[43]
SA Dilliard , Q. Cheng , DJ Siegwart
Sul meccanismo di rilascio di mRNA tessuto-specifico tramite nanoparticelle che si dirigono selettivamente verso gli organi bersaglio.
Proc. Natl. Acad. Sci. , 118 ( 2021 ) , Articolo e2109256118
Visualizza in Scopus Google Scholar
[44]
KJ Kauffman , JR Dorkin , JH Yang , MW Heartlein , F. DeRosa , FF Mir , OS Fenton , DG Anderson
Ottimizzazione delle formulazioni di nanoparticelle lipidiche per la somministrazione di mRNA in vivo mediante disegni fattoriali frazionari e di screening definitivo.
Nano Lett. , 15 ( 2015 ) , pp. 7300 - 7306
Crossref Visualizza in Scopus Google Scholar
[45]
C. Hald Albertsen , JA Kulkarni , D. Witzigmann , M. Lind , K. Petersson , JB Simonsen
Il ruolo dei componenti lipidici nelle nanoparticelle lipidiche per vaccini e terapia genica
Adv. Drug Deliv. Rev. , 188 ( 2022 ) , Articolo 114416
Visualizza PDFVisualizza l'articolo Visualizza in Scopus Google Scholar
[46]
Y. Eygeris , S. Patel , A. Jozic , G. Sahay
Deconvoluzione della struttura delle nanoparticelle lipidiche per la somministrazione di RNA messaggero
Nano Lett. , 20 ( 2020 ) , pp. 4543 - 4549
Crossref Visualizza in Scopus Google Scholar
[47]
H. Wang , H. Pestre , E.-KN Tan , L. Wedemann , JS Schuhmacher , M. Schuhmacher , F. Stellacci
Approccio semplificato per l'ingegneria delle dimensioni delle nanoparticelle lipidiche tramite fusione controllabile indotta da forze di deplezione
J. Colloid Interface Sci. , 691 ( 2025 ) , Articolo 137334
Visualizza PDFVisualizza l'articolo Visualizza in Scopus Google Scholar
[48]
S. Tiwari , V. Atluri , A. Kaushik , A. Yndart , M. Nair
Malattia di Alzheimer: patogenesi, diagnosi e terapie
Int. J. Nanomedicine , 14 ( 2019 ) , pp. 5541 - 5554
Crossref Visualizza in Scopus Google Scholar
[49]
MR Sabuncu , RS Desikan , J. Sepulcre , BTT Yeo , H. Liu , NJ Schmansky , M. Reuter , MW Weiner , RL Buckner , RA Sperling , B. Fischl
Iniziativa di neuroimaging sulla malattia di Alzheimer: la dinamica dell'atrofia corticale e ippocampale nella malattia di Alzheimer
Arch. Neurol. , 68 ( 2011 ) , pp. 1040 - 1048
Crossref Visualizza in Scopus Google Scholar
[50]
M.-G. Li , J.-F. He , X.-Y. Liu , Z.-F. Wang , X. Lou , L. Ma
Alterazioni strutturali e funzionali del talamo nella malattia di Parkinson con lieve deterioramento cognitivo
J. Magn. Risonanza. Imaging , 52 ( 2020 ) , pp . 1207-1215
Crossref Visualizza in Scopus Google Scholar
[51]
C. Owens-Walton , D. Jakabek , BD Power , M. Walterfang , D. Velakoulis , D. van Westen , JCL Looi , M. Shaw , O. Hansson
Aumento della connettività funzionale delle suddivisioni talamiche nei pazienti affetti da malattia di Parkinson.
PLoS One , 14 ( 2019 ) , Articolo e0222002
Crossref Visualizza in Scopus Google Scholar
[52]
Q. Gu , H. Cao , M. Xuan , W. Luo , X. Guan , J. Xu , P. Huang , M. Zhang , X. Xu
Aumento della centralità talamica e della connettività putamen-talamica nei pazienti con tremore a riposo parkinsoniano
Brain Behav. , 7 ( 2017 ) , Articolo e00601
Visualizza in Scopus Google Scholar
[53]
AC Komor , YB Kim , MS Packer , JA Zuris , DR Liu
Modifica programmabile di una base bersaglio nel DNA genomico senza scissione del DNA a doppio filamento.
Natura , 533 ( 2016 ) , pp . 420-424
Crossref Visualizza in Scopus Google Scholar
[54]
R. Palanki , SK Bose , A. Dave , BM White , C. Berkowitz , V. Luks , F. Yaqoob , E. Han , KL Swingle , P. Menon , E. Hodgson , A. Biswas , MM Billingsley , L. Li , F. Yiping , M. Carpenter , A. Trokhan , J. Yeo , N. Johana , TY Wan , M.-G. Alameh , FC Bennett , PB Storm , R. Jain , J. Chan , D. Weissman , MJ Mitchell , WH Peranteau
Nanoparticelle lipidiche ionizzabili per la modifica terapeutica delle basi nelle malattie cerebrali congenite
ACS Nano , 17 ( 2023 ) , pp . 13594-13610
Crossref Visualizza in Scopus Google Scholar
[55]
S.-Y. Yu , T. Carlaw , T. Thomson , A. Birkenshaw , G. Basha , D. Kurek , C. Huang , J. Kulkarni , L.-H. Zhang , CJD Ross
Un modello murino reporter della luciferasi per ottimizzare la modifica genetica in vivo, validato mediante la somministrazione di editor di basi adeniniche tramite nanoparticelle lipidiche.
Mol. Ther. , 31 ( 2023 ) , pp. 1159 - 1166
Visualizza PDFVisualizza l'articolo Visualizza in Scopus Google Scholar
[56]
M. Palmieri , D. Pozzer , N. Landsberger
Terapie genetiche avanzate per il trattamento della sindrome di Rett: stato dell'arte e prospettive future
Front. Neurosci. , 17 ( 2023 ) , Articolo 1172805
Visualizza in Scopus Google Scholar
[57]
JL Neul , P. Fang , J. Barrish , J. Lane , EB Caeg , EO Smith , H. Zoghbi , A. Percy , DG Glaze
Mutazioni specifiche nella proteina 2 legante il metil-CpG conferiscono una diversa gravità alla sindrome di Rett.
Neurologia , 70 ( 2008 ) , pp . 1313-1321
Trovare il PDF…Crossref Visualizza in Scopus Google Scholar
[58]
X. Han , H. Zhang , K. Butowska , KL Swingle , M.-G. Alameh , D. Weissman , MJ Mitchell
Una serie di strumenti a base di lipidi ionizzabili per la somministrazione di RNA.
Naz. Comune. , 12 ( 2021 ) , pag. 7233
Visualizza in Scopus Google Scholar
[59]
MA Maier , M. Jayaraman , S. Matsuda , J. Liu , S. Barros , W. Querbes , YK Tam , SM Ansell , V. Kumar , J. Qin , X. Zhang , Q. Wang , S. Panesar , R. Hutabarat , M. Carioto , J. Hettinger , P. Kandasamy , D. Butler , KG Rajeev , B. Pang , K. Charisse , K. Fitzgerald , BL Mui , X. Du , P. Cullis , TD Madden , MJ Hope , M. Manoharan , A. Akinc
Lipidi biodegradabili che consentono la rapida eliminazione di nanoparticelle lipidiche per la somministrazione sistemica di terapie a base di RNAi.
Mol. Ther. , 21 ( 2013 ) , pp. 1570 - 1578
Visualizza PDFVisualizza l'articolo Crossref Visualizza in Scopus Google Scholar
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Questo articolo fa parte di un numero speciale intitolato: 'Terapie con acidi nucleari' pubblicato su Materials Today.