Il rilascio di protoni del fitocromo indotto dalla luce è accoppiato alla deprotonazione transitoria del cromoforo tetrapirrolico * [box]

Berthold Borucki‡∙Davide von Stetten§∙Sven Seibeck‡∙ … ∙Daniele H. Murgida§∙Maarten P. Heyn‡∙Pietro Hildebrandt§ Hildebrandt@chem.tu-berlin.de…

Abstract
La fototrasformazione P r → P fr del batteriofitocromo Agp1 di Agrobacterium tumefaciens e le strutture del cromoforo biliverdina negli stati parentali e dell'intermedio criogenicamente intrappolato Meta-R C sono state studiate mediante spettroscopia Raman a risonanza e fotolisi flash. Forti somiglianze con gli spettri Raman a risonanza del fitocromo A vegetale indicano che in Agp1 lo stato di isomerizzazione del ponte metinico del cromoforo è ZZZasa in P r e ZZEssa in P fr , con tutti gli azoti pirrolici protonati. La fotoeccitazione di P r è seguita da (almeno) tre componenti di rilassamento termico nella formazione di P fr con costanti di tempo di 230 μs e 3,1 e 260 ms. Lo scambio H₂O /D₂O rivela effetti isotopici cinetici di 1,9, 2,6 e 1,3 per le rispettive transizioni, accompagnate da variazioni delle ampiezze. Il secondo e il terzo rilassamento corrispondono rispettivamente alla formazione e al decadimento di Meta-R C₂ . Le misurazioni Raman di risonanza di Meta-R C₂ indicano che il cromoforo adotta una configurazione ZZE deprotonata . Le misurazioni con un colorante indicatore di pH mostrano che la formazione e il decadimento di Meta-R C₂ sono associati rispettivamente al rilascio e all'assorbimento di protoni. La stechiometria del rilascio di protoni corrisponde a un protone per molecola fotoconvertita. L'accoppiamento tra la deprotonazione transitoria del cromoforo e il rilascio di protoni, che è probabilmente un elemento essenziale nel meccanismo di fotoconversione P₂ → P₂ fr dei fitocromi in generale, può svolgere un ruolo cruciale per i cambiamenti strutturali nella fase finale della formazione di P₂ fr , che commuta tra lo stato attivo e quello inattivo del fotorecettore.

I fitocromi sono fotorecettori che utilizzano la luce come fonte di informazioni per controllare numerosi processi biologici ( 1 , 2 ). Il cromoforo, un tetrapirrolo con ponte metinico ( Fig. 1 ), agisce come un fotointerruttore tra due forme stabili e spettralmente distinte, indicate rispettivamente come P r e P fr in base ai massimi di assorbimento nel rosso e nel rosso lontano. L'interconversione P r / P fr è avviata dalla rapida fotoisomerizzazione Z / E del ponte metinico C - D ( 3 ), seguita da rilassamenti del cromoforo che sono accoppiati a cambiamenti strutturali dell'apoproteina ( 4 ). Questi cambiamenti strutturali sono l'innesco della trasduzione del segnale. La spettroscopia Raman a risonanza (RR) 2 e IR hanno fornito preziose informazioni sui cambiamenti strutturali dei cromofori e delle proteine ​​indotti dalla luce ( ad esempio, vedere i riferimenti 5-10 ), ma i dettagli molecolari e meccanicistici non sono ancora noti e finora non è stata riportata alcuna struttura cristallina di un fitocromo.

FIGURA 1 Formula strutturale dei cromofori BV e fitocromobilina di BV-Agp1 e phyA, rispettivamente. La configurazione e la conformazione del ponte metinico si riferiscono a quelle della forma Pr del fitocromo.

Mentre originariamente si pensava che i fitocromi fossero limitati alle piante, la scoperta di queste cromoproteine ​​nei cianobatteri ( 11 ) e in altri batteri indica l'origine procariotica di questa famiglia di fotorecettori. A differenza dei fitocromi vegetali, i fitocromi batterici tipici sono istidina chinasi regolate dalla luce. Nonostante le funzioni regolatrici piuttosto diverse ( 12 , 13 ), i fitocromi vegetali e batterici mostrano somiglianze strutturali e meccanicistiche. Il cromoforo della fitocromobilina dei fitocromi vegetali e il cromoforo della ficocianobilina dei fitocromi cianobatterici ( 1 , 2 , 11 , 14 ) sono legati covalentemente ai residui di Cys nel cosiddetto dominio GAF. Inoltre, le configurazioni e le conformazioni cromoforiche degli stati parentali, nonché la cinetica di reazione, hanno dimostrato di essere abbastanza comparabili nel fitocromo A vegetale (phyA) e nel fitocromo cianobatterico Cph1 ( 8 ). Per Cph1, sono stati osservati significativi effetti cinetici dell'isotopo H/D e una traslocazione protonica transitoria durante la fotoconversione P r → P fr ( 8 , 15 ). Tuttavia, non è ancora chiaro se il trasferimento protonico si verifichi anche in altri fitocromi e se il cromoforo sia coinvolto.
Un altro gruppo di fitocromi batterici incorpora la biliverdina (BV) come cromoforo ( 14 ), che è legata covalentemente a una cisteina vicino all'estremità N-terminale della proteina ( 13 , 16 , 17 ). Le proprietà biofisiche dei fitocromi che legano la BV non sono ancora state analizzate in dettaglio. Per quanto riguarda la fotoreversibilità P r / P fr e le proprietà spettrali UV-visibili di P r e P fr , questi fitocromi condividono caratteristiche comuni con i loro ortologhi cianobatterici e vegetali. Alla luce delle somiglianze di cui sopra, i meccanismi trovati per i fitocromi batterici potrebbero essere di importanza universale ed essere validi anche per i fitocromi vegetali.
Nel presente lavoro, abbiamo studiato il fitocromo Agp1 recentemente scoperto da Agrobacterium tumefaciens ( 16 ), che appartiene al gruppo dei fitocromi leganti BV. Studi di mutagenesi sito-diretta e spettrometria di massa hanno mostrato che BV è legato covalentemente alla Cys 20 di Agp1 tramite la sua catena laterale vinilica dell'anello A ( 13 , 16 , 17 ). L'addotto BV-Agp1 mostra una fototrasformazione reversibile P r → P fr caratteristica per tutti i rappresentanti della famiglia dei fitocromi. Come in altri fitocromi batterici, l'attività istidina chinasi di Agp1 viene disattivata durante la conversione da P r a P fr ( 16 ).
Abbiamo utilizzato la spettroscopia di assorbimento transitorio e RR per analizzare la fotoconversione P r → P fr di BV-Agp1. Nello specifico, abbiamo studiato (i) la dinamica dell'interazione cromoforo-proteina e lo stato di protonazione della proteina sulla scala temporale μs e ms del ciclo di reazione P r / P fr e (ii) le strutture cromoforiche negli stati parentali e intermedi.

PROCEDURE SPERIMENTALI
Preparazione del campione — L'espressione e la purificazione di Agp1, nonché la formazione dell'addotto BV-Agp1, sono state descritte in dettaglio altrove ( 16 ). La proteina è stata purificata mediante cromatografia di affinità e cromatografia ad esclusione dimensionale. Dopo la cromatografia, BV-Agp1 era essenzialmente pura, come verificato mediante SDS-PAGE (vedere la Figura 1 supplementare). Il rapporto di assorbanza specifico dedotto dagli spettri UV-visibili (Figura 2 supplementare) era di routine compreso tra 0,95 e 1,0. Nei casi in cui erano richieste elevate concentrazioni proteiche, il volume del campione è stato ridotto mediante ultrafiltrazione. Lo scambio di tampone per le misurazioni in D 2 O e per le misurazioni di de/riprotonazione è stato eseguito con l'uso di colonne di desalinizzazione. Per la spettroscopia di assorbimento UV-visibile a bassa temperatura e le misurazioni Raman di risonanza, le soluzioni proteiche contenevano 5 m m EDTA, 300 m m NaCl e 50 m m Tris a un pH e pD di 7,8 rispettivamente in soluzioni di H 2 O e D 2 O. Gli esperimenti di fotolisi flash sono stati eseguiti in 20 m m Tris a pH 7,8 e pD 7,8, rispettivamente, o in soluzioni non tamponate a pH 7,8 contenenti 50 m m NaCl e una concentrazione di 0-120 μ m del colorante indicatore di pH rosso cresolo. Le concentrazioni di BV-Agp1, determinate dall'assorbimento a 700 nm utilizzando un coefficiente di estinzione di 90 m m -1 cm -1 per P r ( 16 ), erano 16-22 μ m e 3 m m rispettivamente nelle misurazioni di assorbimento UV-visibile e spettroscopiche RR. La fotoconversione in P fr e P r è stata ottenuta irradiando la soluzione rispettivamente con luce a 660 e 784 nm, utilizzando un diodo a emissione luminosa, una lampada bianca con filtri appropriati o un diodo laser.

Spettroscopia di assorbimento UV-visibile a bassa temperatura — Gli spettri di assorbimento UV-visibile a bassa temperatura sono stati misurati con un Cary 50 Bio, dotato di un criostato Oxford. Tutti gli esperimenti sono stati condotti con un campione in soluzione tampone acquosa, con la proteina presente in gran parte (>90%) in uno degli stati parentali. La diffusione di fondo risultante dai campioni opachi congelati è stata rimossa sottraendo una curva λ4 adattata dallo spettro misurato.
Spettroscopia di assorbimento UV-visibile transitoria — La fotolisi flash di BV-Agp1 è stata eseguita mediante eccitazione con impulsi da 10 ns utilizzando un laser a colorante pompato a eccimeri con un massimo di emissione a 695 nm (Piridina 1) e un'energia di uscita massima di 5 mJ/cm 2 ( 15 , 18 ). Prima di ogni eccitazione flash, il campione è stato riconvertito in P r a oltre il 95% con illuminazione a 784 nm (60 milliwatt, 20 s). Notiamo che la frazione rimanente di P fr era trascurabile per le misurazioni spettroscopiche di assorbimento transitorio in vista del coefficiente di estinzione inferiore (∼30 m m -1 cm -1 a 695 nm) e della bassa resa quantica (∼0,004) di P fr ( 16 ). Le variazioni di assorbanza sono state monitorate a diverse lunghezze d'onda nella regione Soret (360-450 nm) e nella banda Q (600-800 nm), da 100 ns a 5 s dopo l'eccitazione del flash. I segnali sono stati corretti per le fluttuazioni di energia degli impulsi e lo sbiancamento irreversibile, che è risultato essere del 10% dopo 450 flash laser. Il rilascio (e l'assorbimento) di protoni fotoindotti di BV-Agp1 è stato determinato monitorando le variazioni di assorbanza del colorante indicatore di pH rosso cresolo (p Ka = 8,2) a 570 nm come descritto ( 15 , 19 ). I dati di assorbimento transitorio a più lunghezze d'onda Δ A (λ, t ) sono stati analizzati mediante decomposizione a valori singolari (SVD) e adattamento simultaneo ( 20 , 21 ). Gli spettri di ampiezza B i (λ) sono stati costruiti dai risultati di questa analisi ( 21 ).
Spettroscopia Raman di risonanza — Gli spettri RR sono stati ottenuti con eccitazione a 1064 nm (laser cw Nd-YAG, larghezza di linea < 1 cm -1 ) con uno spettrometro Raman a trasformata di Fourier Digilab Bio-Rad ( risoluzione spettrale di 4 cm -1 ) ( 7 ). Tutti gli spettri sono stati misurati a -140 °C utilizzando criostati raffreddati ad azoto liquido di CryoVac ( 7 ) o Resultec (Linkam). La potenza del laser era compresa tra 400 e 700 milliwatt sul campione, il che non causa alcun danno indotto dal laser sui campioni proteici, come verificato confrontando gli spettri ottenuti prima e dopo una serie di misurazioni. Il tempo di accumulo totale è stato di circa 2 ore per ogni spettro. In tutti gli spettri RR mostrati in questo lavoro, è stato sottratto uno sfondo lineare. Le misurazioni spettroscopiche RR di phyA sono state descritte in precedenza ( 7 ). La preparazione e le misurazioni spettroscopiche RR dei fotoisomeri del dimetil estere BV (BVM) sono state segnalate in precedenza ( 22 ).

RISULTATI E DISCUSSIONE
Cinetica della trasformazione fotoindotta P r → P fr — Le variazioni transitorie di assorbimento di BV-Agp1 in H 2 O e D 2 O, monitorate dopo l'eccitazione a 695 nm, mostrano un comportamento multifasico ( Fig. 2 ), indicando una sequenza di transizioni spettrali nella fotoconversione P r → P fr . Poiché il fotoprodotto primario dei fitocromi, incluso BV-Agp1, si forma su una scala temporale del picosecondo ( 24 ), 3 oltre la risoluzione temporale del presente assetto, la cinetica studiata in questo lavoro si riferisce ai passaggi di rilassamento termico nel percorso verso P fr che procedono su una scala temporale da micro a millisecondi. La formazione di P fr si completa in pochi secondi, come si evince dal segnale a 750 nm ( Fig. 2 C ), che rimane costante dopo circa 3 s. Le variazioni di assorbanza a 700 e 725 nm ( Fig. 2, A e B ) nell'intervallo di tempo 1-5 s sono dovute alla conversione P r → P fr indotta dalla luce della sonda. Nell'intervallo di tempo inferiore a 1 s, l'effetto della luce di misura è trascurabile e i segnali riflettono esclusivamente i processi di rilassamento termico successivi all'eccitazione flash dello stato P r . Come mostrato in Fig. 2 , lo scambio H 2 O/D 2 O influenza sia le costanti di tempo che le ampiezze delle transizioni spettrali P r → P fr .

FIGURA 2 Variazioni transitorie dell'assorbimento di BV-Agp1 in H2O ( linee continue ) e D2O ( linee tratteggiate ), misurate a 700 nm ( A ), 725 nm ( B ) e 750 nm ( C ), dopo eccitazione a 695 nm. I dati rappresentano medie di 40-50 scansioni misurate a 20 °C. Le tracce in H2O e D2O sono state normalizzate alla stessa quantità di molecole fotoconvertite

È stata eseguita un'analisi quantitativa delle tracce temporali ottenute a 35 lunghezze d'onda per l'intervallo di tempo da 2 μs a 1 s. In questo modo, i dati rumorosi inferiori a 2 μs e gli effetti della luce di misura per tempi di irradiazione > 1 s vengono omessi. L'analisi SVD ha rivelato quattro componenti rilevanti in H2O e D2O . Componenti aggiuntive, con valori singolari inferiori all'1% rispetto al valore singolare della prima componente, mostrano tracce temporali molto rumorose e sono state quindi trascurate. Un eccellente adattamento globale alle tracce è stato ottenuto con quattro esponenziali (vedi Fig. 3 ). In H2O sono state ottenute costanti di tempo di 6,9 e 230 μs e 3,1 e 260 ms, indicate da linee verticali tratteggiate in Fig. 3 e riassunte nella TABELLA UNO . La prima componente, che mostra una piccola ampiezza negativa solo al massimo di emissione del laser e che ha essenzialmente la stessa costante di tempo (τ 1 ) in H 2 O e D 2 O, è molto probabilmente dovuta a un artefatto da flash, sebbene non si possa escludere un contributo dovuto alle variazioni di assorbimento di BV-Agp1. Le altre tre componenti, che rappresentano veri e propri processi di rilassamento, mostrano considerevoli effetti dell'isotopo cinetico del deuterio pari a 1,9 (τ 2 ), 2,6 (τ 3 ) e 1,3 (τ 4 ) ( Fig. 3 e TABELLA UNO ). Dalle ampiezze degli adattamenti alle tracce V pesate e agli spettri di base associati, gli spettri di ampiezza sono stati calcolati come descritto in precedenza ( 21 ). Gli spettri di ampiezza B 0 (λ) ( Fig. 4 ), determinati dalle costanti dei fit per le misure in H 2 O e D 2 O, riflettono gli spettri finali estrapolati dopo l'eccitazione flash dello stato P r . Questi spettri concordano molto bene con gli spettri di differenza "P fr - P r " in stato stazionario ridotti ( linee tratteggiate ). Questa concordanza conferma che la cascata di rilassamento della fotoconversione P r → P fr è completata entro la finestra temporale delle misure transitorie e che la costante di tempo τ 4 riflette la formazione dello stato P fr . Dal fattore di scala dello spettro di differenza P fr - P r in stato stazionario, l'efficienza di eccitazione è stata stimata al 20 ± 2%.

FIGURA 3 Tracce temporali dei quattro componenti SVD rilevanti dai dati di assorbimento transitorio di BV-Agp1 a 35 lunghezze d'onda, misurati a 20 °C in H 2 O ( A ) e D 2 O ( B ). Quattro esponenziali ( linee tratteggiate ) sono stati adattati simultaneamente alle tracce V pesate con i rispettivi valori singolari ( linee continue ). Le linee verticali tratteggiate indicano le costanti di tempo degli adattamenti come elencato nella TABELLA UNO .

FIGURA 4 Spettri di ampiezza B i ( λ ) calcolati dalle ampiezze degli adattamenti esponenziali e dai corrispondenti spettri di base SVD, da misurazioni in H 2 O ( A ) e D 2 O ( B ). Le relative costanti di tempo sono riportate nella TABELLA UNO . Le linee tratteggiate sono gli spettri di differenza P fr - P r allo stato stazionario scalati agli spettri B 0 .

Componenti di rilassamento

Solvente        Parametro            B 1.          B2​                  B3                           B4

​H2O​​                    τ                    6,9 μs         230 μs            3,1 millisecondi       260 millisecondi

D 2 O                  τ                    7,3 μs         440 μs            8,2 millisecondi       340 millisecondi
H2O​​               E A /kJ·mol-1                       67 ± 2             86 ± 4                       109 ± 2
D 2 O             E A /kJ·mol-1                       69 ± 3             85 ± 6                       112 ± 5

TABELLA UNO
Costanti di tempo (τ), ampiezze (B i ) ed energie di attivazione ( E A ) della conversione fotoindotta P r → P fr di BV-Agp 1 determinate negli esperimenti di flashphotolysis 

Apri la tabella in una nuova scheda

La componente di rilassamento più breve attribuibile a (veri) cambiamenti di assorbimento del cromoforo (τ 2 ) è caratterizzata da un'ampiezza positiva a circa 725 nm e da una piccola ampiezza negativa al di sotto di 670 nm ( Fig. 4 ). Se rapportate allo stesso numero di molecole fotoconvertite, queste ampiezze sono maggiori di circa il 20% in H 2 O rispetto a D 2 O. Le ampiezze della successiva componente di rilassamento ( Fig. 4 ) mostrano grandi valori positivi e negativi rispettivamente a circa 680 e 760 nm. Mentre l'ampiezza di 680 nm è indipendente dal solvente, l'ampiezza di 760 nm è aumentata in D 2 O. Il quarto componente ( Fig. 4 ) include un'ampiezza negativa nell'intervallo 600-800 nm (massimo a ∼750 nm), che è maggiore di ∼30% in H 2 O rispetto a D 2 O, e contributi positivi (≤400 nm) e negativi (410-450 nm) nella regione della banda di Soret.

Esperimenti di controllo in soluzioni di H₂O contenenti 0,2 mol di saccarosio, corrispondenti alla stessa viscosità del solvente D₂O , rivelano gli stessi dati cinetici ottenuti in assenza di saccarosio (dati non mostrati). Concludiamo, pertanto, che le variazioni delle costanti di tempo e delle ampiezze in D₂O rappresentano veri effetti cinetici degli isotopi.
L'aumento delle temperature nell'intervallo da 10 a 35 °C accelera i decadimenti dei tre componenti rilevanti, mentre le loro ampiezze rimangono pressoché invariate. Le energie di attivazione derivate dai grafici di Arrhenius (dati non mostrati) non differiscono in H2O e D2O entro l'errore sperimentale ( TABELLA UNO ).
Rilascio di protoni fotoindotto — Per rilevare i cambiamenti di protonazione nel mezzo esterno, abbiamo misurato i cambiamenti di assorbimento transitori del colorante indicatore di pH rosso cresolo che è stato aggiunto alla soluzione non tamponata a diverse concentrazioni. Per correggere i contributi della proteina, i cambiamenti di assorbimento sono stati misurati anche senza colorante indicatore di pH. Il segnale del colorante (ΔΔA, la differenza tra i segnali con e senza colorante indicatore di pH) mostra una fase di rilascio di protoni seguita da una fase di assorbimento di protoni e può essere descritto da due esponenziali con costanti di tempo che concordano molto bene con τ 3 e τ 4 determinati per la trasformazione fotoindotta P r → P fr nelle stesse condizioni ( Fig. 5 A ). Pertanto, il rilascio di protoni avviene in modo sincrono con la formazione del precursore di P fr , mentre il successivo assorbimento di protoni può essere correlato alla transizione finale a P fr . La cinetica e il modello di de/riprotonazione sono simili a quelli osservati con il fitocromo cianobatterico Cph1 ( 15 ). La dipendenza delle variazioni di assorbanza (massima) dalla concentrazione del colorante ( Fig. 5 B ) consente di determinare il numero di protoni rilasciati transitoriamente per proteina fotoconvertita ( 19 ), ottenendo un valore di 1,1 ± 0,2. Tuttavia, il rilascio di protoni non è completamente invertito (<50%; Fig. 5 A ), indicando un'acidificazione netta della proteina nello stato P fr , che è stata confermata da misurazioni stazionarie del colorante e dell'elettrodo di pH in P r e nel fotoequilibrio P r /P fr (dati non mostrati).

FIGURA 5 A , variazioni transitorie dell'assorbanza del rosso cresolo a 570 nm a diverse concentrazioni di colorante corrette per i contributi della proteina (Δ A misurato senza colorante), monitorate dopo fotoeccitazione di BV-Agp1 (16 μm ) in H 2 O (pH 7,8). B , valore assoluto del segnale del colorante a diverse concentrazioni di colorante letto dalle tracce a 20 ms ( linea tratteggiata verticale ) in A ( simboli ). La linea continua è un adattamento ai dati con l'equazione 1 del Rif. 12. La linea tratteggiata indica la dipendenza prevista in assenza di effetti di saturazione.

Spettroscopia di assorbimento UV-visibile a bassa temperatura — Dopo la conversione in P r , BV-Agp1 è stato congelato a -140 °C e successivamente irradiato con luce a 700 nm. Anche dopo un'irradiazione prolungata per 30 minuti, non sono state osservate variazioni nello spettro di assorbimento, mentre a temperatura ambiente queste condizioni di irradiazione sono più che sufficienti per convertire BV-Agp1 in P fr . Questa scoperta implica che P r forma un equilibrio fotoreversibile con il fotoprodotto primario che presenta solo una concentrazione fotostazionaria molto piccola o che la fotoconversione è completamente bloccata a bassa temperatura. Tenendo conto del restringimento della banda a bassa temperatura e delle incertezze dovute alla sottrazione di λ 4 , gli spettri di P r e P fr ottenuti con questa procedura sono molto simili a quelli misurati dalla soluzione proteica a temperatura ambiente ( 16 ). Gli esperimenti sono stati ripetuti aumentando gradualmente la temperatura alla quale il campione è stato irradiato. Solo a ∼-25 °C, gli spettri di assorbimento mostrano cambiamenti sostanziali che indicano l'accumulo di uno stato intermedio. Sottraendo il contributo residuo di P r non fotolizzato , si ottiene uno spettro di assorbimento che ricorda lo stato Meta-R C trovato in phyA ( Fig. 6 ) ( 25 ). Lo spettro di differenza "intermedio meno P fr " rivela strette somiglianze con lo spettro di ampiezza della quarta componente di rilassamento (B 4 ) ottenuto nelle misurazioni risolte nel tempo e si ottiene una concordanza ancora migliore per una miscela dell'85% di B 4 e del 15% di B 3 . Pertanto, lo stato intrappolato criogenicamente corrisponde principalmente al precursore di P fr ed è, quindi, indicato come Meta-R C (Agp1) in analogia al precursore P fr di phyA stabilizzato alla stessa temperatura ( 25 ).

FIGURA 6 A , spettri di assorbimento UV-visibile a bassa temperatura di P r ( linea continua ) e P fr ( linea tratteggiata ) da BV-Agp1 misurati a -140 °C. Lo spettro di Meta-R C (Agp1) ( linea tratteggiata ) è stato ottenuto dopo aver irradiato il campione a -25 °C con luce a 700 nm. B , spettro di differenza "P fr " meno "Meta-R C (Agp1)" ottenuto da dati di assorbimento a bassa temperatura in stato stazionario ( linea continua ), confrontato con spettri di differenza costruiti da dati di assorbimento transitorio (-), utilizzando una miscela dell'85% di B 4 e del 15% di B 3 .

Analisi spettroscopica Raman a risonanza delle strutture cromoforiche negli stati parentali — Gli spettri RR degli stati P r e P fr in H 2 O e D 2 O sono stati ottenuti mediante fotoconversione di BV-Agp1 nel rispettivo stato a temperatura ambiente e successivo raffreddamento a -140 °C al buio. Per entrambi gli stati, i modelli complessivi delle bande vibrazionali mostrano ampie somiglianze con gli spettri RR dei rispettivi stati di phyA ( Fig. 7 ). In particolare, le bande prominenti tra 1500 e 1650 cm -1 di P r e P fr mostrano una corrispondenza biunivoca tra phyA e BV-Agp1. Frequenze e intensità relative leggermente diverse derivano principalmente dalle diverse costituzioni chimiche dei cromofori (fitocromobilina contro BV; Fig. 1 ), come indicato dai calcoli preliminari della modalità normale.

FIGURA 7 Spettri RR di P r ( pannello di sinistra ) e P fr ( pannello di destra ) da phyA e BV-Agp1 in H 2 O e D 2 O, misurati a - 140 °C con eccitazione a 1064 nm. Gli spettri degli stati puri sono stati ottenuti per sottrazione reciproca degli spettri grezzi come descritto in precedenza ( 7 ). A causa della ricalibrazione degli spettri RR di phyA, le posizioni delle bande differiscono di 2 cm -1 da quelle riportate in precedenza ( 7 , 10 ).

Per lo stato P r di phyA, è stato dimostrato che il cromoforo adotta la configurazione ZZZasa con tutti gli azoti pirrolici protonati ( 7 , 10 ). La configurazione del doppio legame del cromoforo P fr , che è anche nella forma protonata, è stata dimostrata essere ZZE ( 10 ). Calcoli teorici suggeriscono inoltre una rotazione (parziale) attorno al legame singolo A - B in P fr . Questa conclusione si basa sul sostanziale downshift dello stretching C=C del ponte metinico A - B da 1643 (P r ) a 1618 cm -1 (P fr ), che è riprodotto solo dallo spettro calcolato per la configurazione ZZEssa ( 10 ). In BV-Agp1, il downshift di questa modalità rispetto allo stato P r è pressoché lo stesso di phyA. La banda marcatrice più caratteristica per la forma cationica (protonata) del tetrapirrolo ha origine dalla flessione NH nel piano degli anelli B e C ( 7 ), che porta a bande relativamente intense a 1574 (P r ) e 1555 cm -1 (P fr ) in phyA e a frequenze simili in BV-Agp1. Dopo lo scambio H/D, queste bande scompaiono contemporaneamente a uno spostamento verso il basso di 5 e 7 cm -1 delle bande a 1626 e 1600 cm -1 di P r e P fr , rispettivamente. Questa banda ha origine dallo stiramento C=C del ponte metinico C - D e mostra la più forte intensità RR nei tetrapirroli cationici e neutri in generale ( 7 , 10 ). Tuttavia, questa banda mostra un apprezzabile spostamento verso il basso della frequenza dopo lo scambio H/D solo nella forma cationica.
Pertanto, concludiamo che (i) il rispettivo stato di isomerizzazione del ponte metinico dei cromofori in Pr e Pfr è lo stesso in BV-Agp1 e phyA, ovvero ZZZasa in Pr e ZZEssa in Pfr , e (ii) in entrambi gli stati parentali il cromoforo è protonato. Dettagli sottili nelle strutture dei cromofori possono essere diversi per ciascuno degli stati parentali, come si può dedurre dagli spettri RR di BV-Agp1 e phyA nell'intervallo di frequenza inferiore a 1500 cm -1 .
Struttura cromoforica dell'intermedio Meta-R C (Agp1) — Seguendo il protocollo impiegato nelle misure di assorbimento UV-visibile a bassa temperatura, Meta-R C (Agp1) è stato accumulato e studiato mediante spettroscopia RR. Gli spettri RR ottenuti in queste condizioni includono anche contributi dallo stato genitore non fotolizzato P r , che sono stati sottratti utilizzando bande caratteristiche di P r ( ad esempio a 1626 e 1570 cm -1 in H 2 O) come riferimento ( 7 ).
La banda più prominente nello spettro di Meta-R C (Agp1) in H 2 O ( Fig. 8 A ) attribuibile allo stiramento C=C del ponte metinico C - D si trova a 1590 cm -1 , che è più bassa in frequenza di circa 10 cm -1 rispetto alla banda corrispondente dello spettro P fr ( Fig. 7 ), nonostante la configurazione presumibilmente identica ( E ) del ponte metinico CD . Questa banda rimane sostanzialmente invariata in D 2 O in contrasto con le modalità corrispondenti in P r e P fr (Figg. 7 e 8 A ). Inoltre, nessuna banda attribuibile alla flessione nel piano NH degli anelli B e C è osservata nella regione tra 1500 e 1590 cm -1 , che mostra solo bande deboli che sono invarianti allo scambio H/D. Solo la banda da 1619 cm -1 che origina da una modalità che coinvolge lo stiramento C=C del ponte metinico A - B e un piccolo contributo dell'NH nella flessione piana dell'anello A mostra uno spostamento verso il basso di 4 cm -1 e una diminuzione di intensità in D 2 O. Pertanto, la mancanza delle bande marcatrici per i tetrapirroli cationici indica che il cromoforo in Meta-R C (Agp1) adotta una configurazione ZZE con uno degli anelli interni B o C deprotonato. Questa interpretazione è confermata dal confronto con gli spettri RR dell'isomero ZZE del BVM deprotonato che può essere ottenuto mediante fotoconversione del BVM elicoidale ( ZZZsss ) ( Fig. 8 B ) ( 22 ). Le frequenze e le relative intensità di banda, nonché i cambiamenti spettrali causati dallo scambio H/D sono molto simili a quelli negli spettri di Meta-R C (Agp1).

FIGURA 8 Spettri RR di Meta-R C da BV-Agp1 ( A ) in H 2 O ( solido ) e D 2 O ( tratteggiato ), confrontati con gli spettri dell'isomero ZZE di BVM ( B ) nella forma neutra non deuterata ( linea continua ) e deuterata ( linea tratteggiata ) ( 22 ), tutti misurati con eccitazione a 1064 nm a - 140 °C. Gli spettri in A sono stati ottenuti dopo aver sottratto i contributi da P r come descritto nel testo. Le bande a ∼1650 cm -1 provengono dalle modalità ammidiche I dell'apoproteina, che emergono più fortemente in A che negli spettri RR degli stati genitori a causa del minore potenziamento della risonanza di Meta-R C (Agp1).

Meccanismi della fototrasformazione P r → P fr —Sulla base degli spettri RR disponibili, concludiamo che in BV-Agp1, phyA e Cph1 ( 7 , 8 ), il cromoforo adotta una configurazione ZZZasa protonata e una configurazione ZZEssa protonata rispettivamente in P r e P fr . Mentre in Cph1 e phyA le strutture cromoforiche corrispondenti concordano anche nei dettagli, esistono piccole differenze in BV-Agp1 dovute a interazioni leggermente diverse con l'ambiente proteico che possono essere correlate allo specifico sito di legame del cromoforo in Agp1 e alla diversa costituzione chimica del cromoforo. Tuttavia, è probabile che i cambiamenti strutturali macroscopici del cromoforo durante la conversione P r → P fr siano gli stessi, inclusa l' isomerizzazione del doppio legame Z / E al ponte metinico C - D nel fotoprocesso primario ( 3 , 10 ) e una rotazione termica attorno al legame singolo del ponte metinico A - B. Anche il numero di rilassamenti termici del cromoforo e i loro tempi di decadimento dopo la fotoeccitazione dello stato P r sono simili in BV-Agp1 ( TABELLA UNO ), Cph1 ( 8 , 15 ) e phyA ( 26 , 27 ). Adottando la nomenclatura stabilita per phyA ( 25 ), assegniamo quindi τ 2 , τ 3 e τ 4 ai tempi di decadimento di Lumi-R (Agp1), Meta-R A (Agp1) e Meta-R C (Agp1), rispettivamente. Tuttavia, le variazioni di ampiezza di BV-Agp1 in D 2 O non possono essere riconciliate con un semplice schema di reazione sequenziale, ma indicano il coinvolgimento di reazioni ramificate e/o inverse (equilibri).
Le energie di attivazione per la fotoconversione P r → P fr di BV-Agp1 aumentano nella sequenza dei processi di rilassamento e, almeno, per il primo decadimento (Lumi-R(Agp1)) l'energia di attivazione è più alta (∼67 kJ/mol) rispetto al caso di phyA (50-60 kJ/mol; (28)). Pertanto, è sorprendente che, a differenza di phyA, non sia stato possibile intrappolare criogenicamente né Lumi-R(Agp1) né Meta-RA ( Agp1), e l'unico prodotto di rilassamento stabilizzato a basse temperature è Meta-R C (Agp1), il precursore di P fr . Questa discrepanza suggerisce che in BV-Agp1 il fotoprocesso primario è bloccato fino a una temperatura di ∼-25 °C, oppure gli intermedi Lumi-R(Agp1) e Meta-RA ( Agp1) possono essere efficacemente fotoconvertiti nuovamente in P r .

I processi di rilassamento termico di Lumi-R(Agp1) e Meta-RA ( Agp1) sono associati a effetti isotopici cinetici relativamente grandi, rispettivamente pari a 1,9 e 2,6 ( TABELLA UNO ), che sono quasi grandi quanto quelli osservati per la fotoconversione P r → P fr di Cph1 ( 8 ). Effetti isotopici cinetici di questa entità sono coerenti con un trasferimento protonico come fase limitante la velocità. Mentre l'evento molecolare associato all'effetto isotopico del decadimento di Lumi-R(Agp1) non può essere identificato, la successiva transizione a Meta-Rc(Agp1) è correlata al rilascio protonico di Agp1. Poiché in Meta-Rc(Agp1) il tetrapirrolo è deprotonato, si conclude che il rilascio di protoni è accoppiato alla deprotonazione del cromoforo, che è considerato il passaggio limitante nella formazione di Meta-Rc(Agp1). Una deprotonazione transitoria del tetrapirrolo può derivare dalla riorganizzazione della rete di legami idrogeno associata a una rotazione attorno al legame singolo del ponte metinico A - B , che deve verificarsi durante le fasi di rilassamento termico a P fr . Pertanto, è allettante supporre che questa rotazione sia legata alla deprotonazione del cromoforo in Meta-R C (Agp1), che a sua volta è accoppiata al rilascio transitorio di un protone nel solvente. La successiva riprotonazione del cromoforo in P fr porta solo a un riassorbimento protonico substechiometrico inferiore a 0,5 H +, il che implica che i cambiamenti strutturali della proteina associati alla formazione di P fr causano un'alterazione di ap K di uno (o più) residui protonabili.

Le ampie somiglianze rispetto alle strutture cromoforiche negli stati parentali e alla cinetica dei processi fotoindotti in Agp1, Cph1 e phyA suggeriscono che la conversione P r → P fr procede attraverso lo stesso meccanismo in tutti i fitocromi. Come mostrato in questo lavoro, la deprotonazione transitoria del cromoforo rappresenta un passaggio di reazione cruciale in questo meccanismo. Il rilascio di protoni e l'assorbimento (parziale) associato all'ascesa e al decadimento di Meta-R C potrebbero essere osservati con Agp1 (questo studio) così come con Cph1 ( 15 ). Tuttavia, finora, un intermedio con un cromoforo deprotonato è stato identificato in modo univoco solo in Agp1. Per phyA, gli studi spettroscopici RR hanno portato a conclusioni contrastanti sullo stato di protonazione di Meta-R C ( 5 , 7 ), sebbene queste discrepanze potrebbero essere dovute al coinvolgimento del cromoforo in un equilibrio acido-base. Poiché le posizioni di tali equilibri dipendono sensibilmente dall'ambiente proteico locale dei vari fitocromi, l'accumulo della forma deprotonata di Meta-R C , sufficiente per un'identificazione spettroscopica sicura, potrebbe non essere possibile in ogni caso. Infatti, gli effetti H/D sulle ampiezze delle fasi di rilassamento termico della fototrasformazione P r → P fr osservati per Agp1 in questo lavoro sono coerenti con gli equilibri acido-base. Pertanto, concludiamo che l'accoppiamento tra cambiamenti strutturali del cromoforo e traslocazione protonica rivelato per BV-Agp1 è un elemento essenziale per il meccanismo di reazione fotoindotto dei fitocromi in generale, e solo i dettagli della cinetica e delle posizioni degli equilibri acido-base potrebbero essere diversi tra i vari rappresentanti di questa famiglia di fotorecettori.

Materiale supplementare (1)
PDF (428,58 KB)

Riferimenti
1.
Kendrick, RE ∙ Kronenberg, GHM
Fotomorfogenesi nelle piante. Kluwer, Dordrecht, Paesi Bassi, 1994
Riferimento incrociato
Google Scholar
2.
Quaglia, PH
Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2002; 3 :85-93
Riferimento incrociato
Scopus (624)
PubMed
Google Scholar
3.
Rüdiger, W. ∙ Thümmler, F. ∙ Cmiel, E. ...
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1983; 80 :6244-6248
Riferimento incrociato
PubMed
Google Scholar
4.
Canzone, PS
J. Biochimica. Mol. Biol. 1999; 32 :215-225
Google Scholar
5.
Mizutani, Y. ∙ Tokutomi, S. ∙ Kitagawa, T.
Biochimica. 1994; 33 :153-158
Riferimento incrociato
Scopus (58)
PubMed
Google Scholar
6.
Andel Spaceiiiqq, F. ∙ Lagarias, JC ∙ Mathies, RA
Biochimica. 1996; 35 :15997-16008
Riferimento incrociato
Scopus (103)
PubMed
Google Scholar
7.
Kneip, C. ∙ Hildebrandt, P. ∙ Schlamann, W. ...
Biochimica. 1999; 38 :15185-15192
Riferimento incrociato
Scopus (128)
PubMed
Google Scholar
8.
Remberg, A. ∙ Lindner, I. ∙ Lamparter, T. ...
Biochimica. 1997; 36 :13389-13395
Riferimento incrociato
Scopus (76)
PubMed
Google Scholar
9.
Foerstendorf, H. ∙ Benda, C. ∙ Gärtner, W. ...
Biochimica. 2001; 40 :14952-14959
Riferimento incrociato
Scopus (80)
PubMed
Google Scholar
10.
Mroginski, MA ∙ Murgida, DH ∙ von Stetten, D. ...
J. Am. Chem. Soc. 2004; 126 : 16734-16735
Riferimento incrociato
Scopus (81)
PubMed
Google Scholar
11.
Hughes, J. ∙ Lamparter, T. ∙ Mittmann, F. ...
Natura. 1997; 386 :663
Riferimento incrociato
Scopus (303)
PubMed
Google Scholar
12.
Vierstra, RD ∙ Davis, SJ
Semin. Cell Dev. Biol. 2000; 11 :511-521
Riferimento incrociato
Scopus (65)
PubMed
Google Scholar
13.
Lamparter, T.
FEBS Lett. 2004; 573 :1-5
Riferimento incrociato
Scopus (101)
PubMed
Google Scholar
14.
Bhoo, SH ∙ Davis, SJ ∙ Walker, J. ...
Natura. 2001; 414 :716-719
Riferimento incrociato
Scopus (268)
PubMed
Google Scholar
15.
van Thor, JJ ∙ Borucki, B. ∙ Crielaard, W. ...
Biochimica. 2001; 40 :11460-11471
Riferimento incrociato
Scopus (105)
PubMed
Google Scholar
16.
Lamparter, T. ∙ Michael, N. ∙ Mittmann, F. ...
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002; 99 :11628-11633
Riferimento incrociato
Scopus (172)
PubMed
Google Scholar
17.
Lamparter, T. ∙ Carrascal, M. ∙ Michael, N. ...
Biochimica. 2004; 43 :3659-3669
Riferimento incrociato
Scopus (119)
PubMed
Google Scholar
18.
Borucki, B. ∙ Otto, H. ∙ Heyn, deputato
J. Fisica Chimica B. 1999; 103 :6371-6383
Riferimento incrociato
Scopus (28)
Google Scholar
19.
Borucki, B. ∙ Devanathan, S. ∙ Otto, H. ...
Biochimica. 2002; 41 :10026-10037
Riferimento incrociato
Scopus (53)
PubMed
Google Scholar
20.
Henry, ER ∙ Hofrichter, J.
Metodi Enzimol. 1992; 210 :129-192
Riferimento incrociato
Scopus (652)
Google Scholar
21.
Borucki, B. ∙ Otto, H. ∙ Rottwinkel, G. ...
Biochimica. 2003; 42 :13684-13697
Riferimento incrociato
Scopus (59)
PubMed
Google Scholar
22.
Matysik, J. ∙ Hildebrandt, P. ∙ Smit, K. ...
J. Pharmacol. Biomed. Anal. 1997; 15 :1319-1324
Riferimento incrociato
Scopus (17)
PubMed
Google Scholar
23.
Heyne, K. ∙ Herbst, J. ∙ Stehlik, D. ...
Biofisica. J. 2002; 82 :1004-1016
Testo completo
Testo completo (PDF)
Scopus (103)
PubMed
Google Scholar
24.
Eilfeld, P. ∙ Rüdiger, W.
Z.Naturaforsch. 1985; 40C :109-114
Riferimento incrociato
Scopus (96)
Google Scholar
25.
Schmidt, P. Gensch, T., Remberg, A., Gärtner, W., Braslavsky, SE ∙ Schaffner, K.
Fotochimica. Fotobiol. 1998; 68 :755-762
Google Scholar
26.
Aramendía, PE ∙ Ruszicska, BP ∙ Braslavsky, SE ...
Biochimica. 1987; 26 :1418-1422
Riferimento incrociato
Scopus (42)
Google Scholar
Riferimento non citato
1.
Zhang, CF ∙ Farrens, DL ∙ Björling, SC ...
J. Am. Chem. Soc. 1992; 114 : 4569-4580
Riferimento incrociato
Scopus (66)
Google Scholar

Esseri non terrestri che aiutano la Terra

https://prepareforchange.net/2025/06/10/non-terrestrial-beings-aiding-earth/

I ritrovamenti archeologici stanno cambiando radicalmente la nostra idea della vera storia. Sta diventando sempre più evidente che sono esistite numerose varianti di esseri umani, come dimostrano i numerosi resti scheletrici rinvenuti nell'ultimo secolo. È evidente che la nostra vera storia sia stata occultata per impedirci di scoprire la nostra vera eredità.

Stiamo iniziando a comprendere il grande potenziale che abbiamo e un destino di grandi altezze che va oltre la nostra immaginazione. Tutto questo cambierà presto, perché la verità non potrà essere tenuta nascosta ancora a lungo mentre viene rivelata. La verità è quasi troppo difficile da credere per alcuni, quindi mantenete una mente aperta quando inizierà a essere rivelata, perché a volte sembrerà incredibile. Le prove della nostra vera storia vengono scoperte quasi ogni giorno, ma c'è ancora una certa riluttanza a renderle pubbliche. Quando ciò accadrà, colpirà duramente alcune credenze religiose, ma eliminando gli insegnamenti che non riflettono pienamente la verità, saranno molto più facili da comprendere.

Il grande passaggio dall'oscurità alla luce sta avvenendo

stopworldcontrol.

Molti ancora non ci credono, ma il mio reportage continuerà a rivelare che stiamo assistendo al più grande passaggio dall'oscurità alla luce, di sempre. La maggior parte di ciò che leggerete qui sotto sta attualmente accadendo negli Stati Uniti d'America, ma presto diventerà mondiale.

La censura è stata messa fuorilegge in America e il libero flusso della verità è stato ripristinato, il che accenderà il risveglio come mai prima. Tutti i tentativi delle élite sataniche di mettere a tacere la voce della verità sono falliti e vedremo una rinascita di massa della verità raggiungere il mondo intero.

COBRA-10 ottobre 2023- Aggiornamento della situazione

COBRA
Come è stato detto qualche mese fa, le cose stanno accelerando molto rapidamente dalla fine di settembre.

Innanzitutto, i biochip fisici sono stati eliminati e tutto ciò che rimane in quelle posizioni del corpo è un circuito morto e inattivo del biochip. Questi residui di biochip sono anche punti deboli attraverso i quali il Lurker può manifestare fluttuazioni quantistiche distorte e plasma anomalo generato dallo spazio non quantistico.

Lurker emana anche anomalie dal non-spazio subquantico attraverso fluttuazioni quantistiche e distorcono l'essenza elementale attorno alla superficie del pianeta sui piani plasmatico, eterico, astrale e mentale. Lurker può quindi dirigere e manipolare questa essenza elementale per influenzare l'umanità di superficie aumentando o diminuendo la quantità di fluttuazioni quantistiche in vari punti di quell'essenza elementale.

Sono state rilasciate ulteriori informazioni sul Lurker. Lurker è in realtà un conglomerato di tutti gli esseri che sono stati proiettati nell'unspazio subquantico con tecnologie estremamente potenti in tutti i cicli cosmici precedenti. La prima proiezione di questo tipo si è verificata all'inizio dei tempi nel primo ciclo cosmico, quando la Sorgente era consapevole dell'esistenza di qualcosa di strano come l'anomalia primaria. Quindi la Sorgente decise di proiettare una parte di se stessa in quell'anomalia per comprenderla e risolverla, e quella parte proiettata rimase intrappolata nell'anomalia subquantica e divenne il primo, primordiale Lurker, con altri Lurker da seguire nei successivi cicli cosmici:
http://www.thenewearth.org/returnoflight.html

Il Ritorno del Sole come festività originale del Natale

Yule

di Donatella Manca
Sin dalla antichità a Nord dell’Emisfero Boreale, dalla Siberia alle Isole Britanniche, passando poi per l’Europa centrale fino al Mediterraneo, fiorirono leggende e mitologie che portarono a tradizioni, celebrazioni, rituali e festività che avevano come oggetto, la notte più lunga dell’anno, il solstizio d’inverno.

Gli antichi osservavano il mistero della notte, delle ore di luce durante la giornata, nello scorrere del tempo del giorno e si stupivano dinanzi al fenomeno cosmico del Solstizio d’Inverno. Osservavano la durata delle ore di buio e la notte in assenza del Sole, e vedevano come quasi d’incanto poi il Sole, la Luce rinasceva, dopo la morte del Sole, in modo immediato e con incremento rapido e progressivo. Dal 21 al 25 Dicembre la luce rinasceva ed era splendente di nuovo nonostante si entrasse nell’inverno rigido e freddo.

Per questo presero a festeggiare il periodo di preparazione al Solstizio d’Inverno, come momento di disporsi interiormente al ritorno della Luce. La Luce che dona vita e vitalità come ritorno e presenza tangibile nel mondo ed in ogni cosa, della Bellezza di Dio. Dio Padre infatti si fa sentire dall’Umanità terrestre attraverso la bellezza del Mondo che è la Sua Bellezza, quello che di Lui può essere percepito dall’Umanità. Così quei popoli festeggiavano il ritorno del Sole, della sua Luce, la sua rinascita ed era una grande Festa che univa tutti.

LA FEDERAZIONE GALATTICA È QUI PER AIUTARE

Aurora Ray Federerazione Galattica

Fonte
La Federazione Galattica è quì per aiutare e guidare i figli della luce, o semi stellari, per aiutarli visto che molti di voi siete membri della federazione galattica: Avete sentito la chiamata. La terra ha bisogno di aiuto del vostro volontariato. 

Starseeds (semi stellari) e il linguaggio delle vibrazioni (frequenze)

La Federazione Galattica è qui in missione di pace. Ma il motivo principale di questa missione sei TU. Come individuo magnifico, sei fondamentale per questo movimento di ascensione collettiva. Insieme aumenteremo la frequenza vibrazionale della Terra e navigheremo attraverso il mare della confusione verso la terra dell'illuminazione.

Messaggio di Matthew Ward: Ultimo atto di luce contro oscurità

Matthew Ward

Da eraoflight.com:
Con affettuosi saluti da tutte le anime in questa stazione, si rivolge a tutti noi, questo è Matteo. L'ultimo atto prima che cada il sipario sul dramma delle forze della luce contro le forze oscure che si sta svolgendo sulla Terra sta diventando sempre più attivo.

Ciò include lo sradicamento dell'ultima roccaforte degli Illuminati, le alleanze internazionali per elevare la vita in tutto il mondo, il numero crescente di menti e cuori oscuri che vengono portati via dal pianeta, l'esposizione dei loro sosia e altre verità che iniziano a emergere. E i popoli stanno contribuendo alla caduta di una diabolica rete globale di cui non sanno l'esistenza. Chiedendo ai loro governi di soddisfare i bisogni dei cittadini, il crescente potere dei movimenti di base sta aiutando gli sforzi del gruppo internazionale per liberare i paesi da tutti gli individui che stanno servendo quella sinistra rete.

Chi è Ashtar - Missione e scopi

Chi è Ashtar - Missione e scopi 

Agosto 2019. 

Gabriel RL 

Sa Defenza 

Saluto la Famiglia,

Miei cari esseri umani, oggi vengo da voi per parlarvi della nostra missione e dei nostri scopi. Parlo in un modo da renderci  più vicini a ciascuno di voi su questo bellissimo pianeta. Voglio parlare della mia natura spirituale in modo da poter essere ancor più nel vostro cuore come fratello e compagno. 

Voglio spiegarVi perché non interveniamo immediatamente in alcuno dei conflitti sulla Madre Terra. Ci sono molte ragioni che ci assicurano che sarete in grado di avviare un movimento per la pace vero e duraturo. Inoltre, vi parlerò della diffusione dei nostri messaggi, nonché dei messaggi che non hanno la nostra firma energetica e che possono confondervi e screditarci.

Chi è Ashtar?

Molto tempo fa, quando non c'erano ancora esseri umanoidi sulla faccia del tuo pianeta Terra, già ero, ed eravamo già insieme. Ci sono molte informazioni su me su Internet, positive e non positive. Il modo in cui mi vedono se mi accettano o meno come loro fratello è interamente una questione di scelta. Vi amo comunque, e nulla cambierà questo.

Sono un essere angelico di natura pacifica e riparatrice. Ho tre toni energetici nel mio cuore che vibrano: blu, bianco e giallo dorato. Sono un flusso di vita dell'Arcangelo Michele, che conosci, posso dire che sono un Raggio della tua Coscienza, se questo ti diventa più chiaro. Proprio perché sei incarnato sul pianeta e sei un Raggio del tuo Sé Superiore, io sono un Raggio di Michele "Incarnato" in questo abito Galattico. Sono una manifestazione della tua stessa essenza in questo quadrante. La mia missione particolare è quella di garantire il passaggio alle dimensioni superiori in modo sicuro e pacifico. Assicurati che i tuoi doni divini vengano ripristinati man mano che il tuo sacro DNA viene riattivato. E, grazie al Potere Superiore, ci stiamo riuscendo, perché tu lo hai scelto, il che ci rende felici.

Come fratello che conosce la strada umana percorsa sin dal tuo inizio, ti assicuro che hai compiuto progressi tali da ridurre al minimo, della tua estinzione, la possibilità di un terzo cataclisma. A molti che vibrano ancora in una tale possibilità, chiediamo: smettete di sostenere questa energia di guerra e caos. In tal modo, saranno condotti naturalmente a vivere in altri mondi; Ad ogni modo, ci stiamo già "dirigendo laggiù". 

Qui, su questo pianeta, in questa linea temporale a cui mi sto rivolgendo ora, l'uso di armi nucleari non sarà più consentito, come è stato detto prima, ma lo diciamo di nuovo; interverremo fermamente e amorevolmente per impedire tale azione. Abbiamo già avvertito i vostri leader mondiali di disattivare le loro testate, o lo faremo da soli. Abbiamo il permesso dall'alto per quello. Gran parte di ciò che ti viene mostrato nelle tue notizie è semplicemente un "espediente di marketing" di coloro che vogliono  tenervi nella oppressione dettata dalla paura. Molte delle cosiddette armi nucleari o missili detonati che mostrano nelle notizie sono false e non hanno alcun potere. Lo fanno per farvi prendere dal panico e, quando lo sei, dai loro potere.


Io, stando più vicino a te, posso assicurarti che il tuo mondo, che mi è stato affidato dalle entità superiori responsabili di questo quadrante universale, è ben protetto dalla mia flotta . Come sapete, abbiamo protetto a lungo la Madre Terra nel suo insieme e l'abbiamo fatto con amore. Questo compito non è solo nostro, come pattugliatori dell'ordine universale, ma di tutti voi che siete nostri alleati sulla terra. Ti assicuro, ancora una volta, che sei responsabile degli eventi nel tuo mondo, poiché gli emissari dall'alto hanno il compito di mantenere la Pace e l'armonia attraverso atteggiamenti amorevoli e compassionevoli. Siamo una squadra, noi della Ashtar Command non lavoriamo da soli dall'alto,  in terra sei tu l'estensione del nostro comando. Perciò onora la tua posizione di missionario della più alta luce, miei cari.  Molte persone mi paragonano a un comandante. In particolare, vorrei essere chiamato fratello. La funzione che mi è stata affidata è in verità il comando, ma il comando generale che ci muove è l'amore nei cuori di tutti coloro che lavorano con me al servizio dell'Amore Supremo del Cosmo. Quindi chiunque abbia l'amore nel cuore è un comandante.

L'amore è il comando supremo dell'azione per ogni cosa.

A molte persone potrebbero non piacere queste mie parole, poiché nelle loro credenze pensano di essere inferiori a certi esseri che considerano superiori. Non esiste una cosa del genere tra noi, miei cari, ci vediamo sempre come una squadra e il leader è l'amore nel cuore. 

Ci sono molte controversie sul motivo per cui sono qui sul vostro pianeta, lasciatemi provare a spiegare in modo che le vostre menti tridimensionali possano concepire quanto vi dico:

1 - La posizione di comando che occupo mi dà l'autorità di agire in mondi in cui domina l'oscurità. Questa azione e le squadre che lavorano con me non possono in alcun modo andare oltre un certo limite: il libero arbitrio. Non l'abbiamo mai violato, onoriamo le scelte di tutti gli esseri. In questo caso, ci preoccupiamo che il tuo libero arbitrio non sia violato da entità che desiderano, ad esempio, eseguire esperimenti nel tuo mondo, al di là di ciò che sarebbe consentito dall'autorizzazione dei manipolatori stessi attraverso le vibrazioni che compongono le idee di tali entità . C'è sempre una limite che determina fino a che punto possono agire e quando il limite viene raggiunto, arriviamo. Alcuni esseri che lavorano con l'oscurità rispettano il libero arbitrio, ma altri no. Uno dei nostri compiti è prevenire la violazione del tuo libero arbitrio. Tuttavia, quando decidono in modo vibrante per amore, tale violazione diventa impossibile a meno che non lascino lacune di insicurezza e paura. In questo caso, significa che la luce dell'amore non è ancora completamente ancorata nel tuo cuore, il che provoca i cosiddetti "alti e bassi" che a volte provi. 

2 - Il tuo pianeta Shan (Terra) è in fase di Ascensione e cambio di polarità. La Madre Terra si sposterà verso dimensioni superiori come è ora, trascinando tutti i regni che la abitano. Questi cambiamenti influenzano non solo il tuo pianeta, ma l'intero universo. Sul lato fisico, ci sono sempre movimenti che possono compromettere l'integrità materiale manifestata. Una delle nostre funzioni è quella di garantire che coloro che vivono fisicamente non siano interessati, quelli che, per loro spontanea volontà, non devono attraversare situazioni che non hanno scelto. Usiamo il "libero arbitrio" qui, perché nessuna creatura di Dio attraversa difficoltà senza se stesso generandola, direttamente o indirettamente tramite l'uso del suo diritto di scelta. 

3 - Abbiamo anche la responsabilità di garantire che durante questo processo di transizione a nessuna entità esterna al vostro pianeta sia permesso di interrompere il processo. Ci sono molti esseri di molti quartieri che desiderano disturbarvi e stanno aspettando un'opportunità. Alcuni di loro vogliono interagire direttamente con il processo, che è consentito solo fino a un certo punto. Come gruppo che assiste i mondi nei processi evolutivi, abbiamo in noi l'amore e il rispetto per tutti coloro che stanno attraversando il momento chiave della loro evoluzione. Non interveniamo mai e non consentiamo l'intervento quando abbiamo il seguente ordine: "Le entità contrarie non devono superare il seguente limite ...", che eseguiamo per soddisfare gli scopi più elevati.

Amiamo tutti gli esseri nell'universo e siamo sempre felici quando abbiamo l'opportunità di portare alcuni degli abitanti di Shan a bordo di una delle nostre navi madri. Io, Ashtar, ho già preso contatto con molti sul tuo pianeta, sono andato il più lontano possibile e mi è stato permesso di ottenere questo contatto più umano. È sempre meraviglioso essere alla presenza di fratelli come te che credono in noi e guardano il cielo in attesa di un nostro segno  come prova che stiamo vegliando su di te. Desideriamo essere trattati come fratelli uguali, mai superiori a te. La luce del nostro cuore è la stessa che porti, non c'è differenza. Qualsiasi informazione che si dice provenga da noi che non ha questa traccia di informazioni, ti chiediamo di rivederla attentamente. Ci sono persone che cercano di impersonarci in certe occasioni, e questo è ancora permesso, che tu possa ottenere sempre più il potere del discernimento. Ne abbiamo già parlato in altri messaggi.

Amati esseri umani, poiché la vostra famiglia non può essere diversa, amiamo ognuno di voi e vogliamo davvero atterrare e guardarvi negli occhi. Non siamo i vostri salvatori, ma i vostri fratelli che osservano i vostri progressi da migliaia d'anni e che desiderano interagire con voi. Credeteci, spesso scendiamo e camminiamo in mezzo a voi in modo che tu non possa ancora rendertene conto, vorremmo toglierci il velo e stringere i legami.

Chi è reale?

Ci sono molte mie lettere sparse sul vostro pianeta e quelle che affermano di essere mie, e molte che usano il mio nome ma non contengono le mie parole. L'unico modo per sapere se sono io che  sto parlando quando vi applicate e mettete l'energia del tuo cuore nel leggere o nell'ascoltare quelle parole vi do una traccia per riconoscermi. 

Vi lascio 5 criteri da analizzare nei miei messaggi:

1 - Noi, amati esseri umani, non offendiamo o usiamo mai parole che denigrano l'immagine di qualsiasi altro essere o sbilanciano qualcosa. Il nostro lavoro è unire. Veniamo dall'Ordine Universale e lo sottolineeremo sempre. 

2 - Onoriamo tutti sul vostro pianeta, anche coloro che agiscono per  farvi del male nei vostri progressi sono da noi amati. Non c'è differenza. Onoriamo e amiamo tutti allo stesso modo. 

3 - Realizzate nei vostri cuori la luce che inviamo, perché vi sia sempre familiare. I nostri messaggi toccano il vostro cuore perché sembra un messaggio della Famiglia. Come quando un parente si trova dall'altra parte del mondo, in un altro paese e vi chiama o vi invia un'e-mail. Il cuore si rallegra di riceverlo. Realizza se lo senti quando leggi i nostri messaggi. 

4 - I nostri messaggi vi immergono nello spirito della speranza, luce e amore. Ascolta e osserva i Codici della Luce entrare nei tuoi occhi e diffondersi attraverso i tuoi Chakra. Questa energia è percepita nei nostri messaggi. Se non riesci a sentirlo in questo momento, respira e donati con cuore. 

5 - In nessun modo ti chiederemo di abbandonare il tuo libero arbitrio. Non vi inciteremo mai alla violenza o alla paura. Non vi sminuiremo e non vi renderemo meno degni. Siete esseri divini e sarete sempre trattati così. Indipendentemente dal fatto che accettiate o meno le credenze limitanti di alcuni, li onoriamo innamorati del loro libero arbitrio. Ricordate, la paura è sempre lo strumento più potente delle forze oscure. I nostri messaggi non intendono incitare all'odio, alla vendetta, alla distruzione, alla demoralizzazione, alla discordia o ad altri sentimenti simili. Siamo un gruppo che lavora al servizio della Grande Energia, di cui fate tutti parte, l'Energia Suprema che governa tutte le cose. Credetemi, non c'è altro modo di conoscere la verità di un messaggio, se non attraverso il discernimento del cuore.

Desideriamo esporre le nostre navi in ​​una particolare regione del tuo mondo in segno di saluto ai popoli di Shan. Quello che possiamo dire è che vogliamo che sia durante il giorno e sopra le acque. Non ci sono date che possiamo darvi, perché ciò potrebbe generare qualche aspettativa e speriamo solo che vibrerai innamorato perché si manifesti. La nostra intenzione è quella di essere più vicini a te in modo che tu possa sentirti sempre più in sintonia familiare con noi.

C'è molta eccitazione dietro le quinte dei vostri governi in questo momento, poiché si trovano ad affrontare un enorme impasse nel rivelare o meno la nostra presenza. Tale divulgazione mira a preparare le persone al nostro aspetto di massa in tutto il pianeta. Non lo faremo fino a quando non saremo certi che alcune situazioni siano state risolte dai nostri alleati terrestri che lavorano incessantemente per renderlo possibile. Vi avvertiamo che tutte le minacce contro di voi sono sotto stretta sorveglianza dei nostri team e ci assicuriamo costantemente che le testate nucleari sono disattivate. La nostra tecnologia può neutralizzare la vostra in un batter d'occhio e in questo momento potremmo fermare qualsiasi altra minaccia diretta al vostro pianeta.

Pertanto, mantenete i vostri cuori allineati con la Sorgente, cercando di fare del vostro meglio per tutti, in modo che possano essere immersi dalla luce e quindi allineati con noi, permettendoci  di raggiungere il vostro pianeta in modo da non causare  tanto clamore.

Le minacce contro di voi possono essere contrastate in una certa misura ed è tuo personale compito mantenere la tua mente allineata con il vostro cuore in Amore e Luce. Ancora e ancora è stato detto che la tua vibrazione è la vostra parola. Rafforziamo questa frase dicendo che ogni pericolo contro la tua vita e quello del vostro pianeta è smantellato con ogni gesto d'amore che fate. Credeteci. Nessuno nel tuo mondo che agisce in collusione con forze negative dall'esterno ha più potere di te che sei allineato con la forza del cuore. Tu, con l'amore nel tuo cuore, solo tu hai il potere che unisce tutte le cose ed è in grado di risolvere situazioni conflittuali come guerre e minacce di guerre. Queste situazioni devono essere esposte, devono venire alla Luce, ma sei tu a decidere se continuare o fermarti in modo permanente. Lo sporco viene esposto, ora sei tu che hai davanti la scopa e la guardi. Hai intenzione di fare qualcosa?

Le energie della luce continuano ad entrare in Shan e, come ho già detto nel mio messaggio precedente, stai attraversando un momento molto speciale. E quel momento richiederà sempre più fede e determinazione. Ti viene dato più potere con la riattivazione del tuo DNA. Speriamo e confidiamo che tu sappia cosa fare. Siamo sempre nel reciproco vibrante incoraggiamento . Chiamaci e saremo lì. Chiamaci ora e sentirai la nostra presenza.

Siamo al tuo comando, sempre nell'amore.

E così sia.

Vi benedico,

Vostro fratello,

Ashtar

*****

https://sadefenza.blogspot.com/2019/08/chi-e-ashtar-missione-e-scopi.html

Sa Defenza non effettua alcun controllo preventivo in relazione al contenuto, alla natura, alla veridicità e alla correttezza di materiali, dati e informazioni pubblicati, né delle opinioni che in essi vengono espresse. Nulla su questo sito è pensato e pubblicato per essere creduto acriticamente o essere accettato senza farsi domande e fare valutazioni personali.

Grazie al nostro canale Telegram potete rimanere aggiornati sulla pubblicazione di nuovi articoli ISCRIVITI AL NOSTRO CANALE TELEGRAM